S presejalnimi analizami nekaterih pogostih rastlinskih triterpenoidov in fitosterolov v ekstraktih kutikularnih voskov različne zelenjave (bučke, jajčevec, paradižnik, rdeča paprika, blitva, špinača, solata, beli radič di Castelfranco, radič Leonardo, belo zelje, rdeče zelje in ohrovt), ki smo jih izvedli s tremi TLC metodami, smo potrdili, da je proučevana zelenjava potencialni vir triterpenoidov in fitosterolov. Razvili smo prvo TLC-MS/MS metodo, ki omogoča identifikacijo osmih triterpenoidov (lupeol, α-amirin, β-amirin, cikloartenol, cikloartenol acetat, lupeol acetat, lupenon in friedelin) in dveh fitosterolov (β-sitosterol in stigmasterol) v ekstraktih zelenjave. Prednosti te metode so: (1) zadovoljiva ločba ciljnih spojin; (2) razlikovanje med spojinami na podlagi barve lis; in (3) možnost razlikovanja med spojinami glede na njihove MS in MS/MS spektre. Za razlikovanje med MS/MS spektri spojin, ki se eluirajo blizu skupaj, smo predlagali značilne produktne ione. Poleg tega smo si identifikacijo spojin olajšali z izdelavo masno spektralne knjižnice z MS/MS spektri ciljnih spojin in z “glava-rep” (angl. “head to tail”) načinom primerjave ustreznih MS/MS spektrov spojin vzorcev in standardov zagotovili visoko stopnjo zanesljivosti rezultatov. Razvita metoda z uporabo kemijske ionizacije pri atmosferskem tlaku (APCI) v pozitivnem načinu podaja poleg informacije o molekulski masi tudi strukturne informacije o spojini, kot so npr. funkcionalne skupine. S takšnim pristopom smo v zelenjavnih voskih identificirali številne spojine, od katerih smo jih več kot polovico prvi identificirali v določeni vrsti zelenjave. Prva razvita TLC-MS/MS metoda bo omogočila identifikacijo triterpenoidov in fitosterolov s protirakavim in protivnetnim delovanjem tudi v drugih vrstah zelenjave in sadja in tako dodatno podprla študije, ki bodo ocenile dnevni vnos teh pomembnih spojin z biološko aktivnostjo.
COBISS.SI-ID: 5635354
Predstavljena je novo razvita celostna tehnika TLC x GC z uporabo vzorčenja iz nadprostora. Glavna prednost tega pristopa je, kot smo dokazali na primeru analize lipidov, možnost vključitve transesterifikacije gliceridov v metilne estre maščobnih kislin, ker ni posebnih časovnih omejitev pri sklopitvi TLC in GC tehnike. Poleg tega, da je to cenovno ugodna rešitev, saj ima TLC x GC tehnika z uporabo vzorčenja iz nadprostora veliko prednosti z vidika fleksibilnosti pogojev separacije in modulacije vzorčenja. Tehnika omogoča linearno območje preko dveh dekad pri TLC nanosih okrog 1 mg vzorca z dobro ponovljivostjo in točnostjo, kar smo dokazali preko večkratnega zaporednega vzorčenja iz nadprostora. Tehnika predstavlja možno alternativo uveljavljeni, a dražji tehniki HPLC x GC. Uporabno delovno območje tehnike TLC x GC v smislu hlapnosti analitov bi bilo možno še dodatno razširiti z razvojem vzorčevalnih naprav na osnovi termične desorpcije. Ker je vpeljava metode razmeroma enostavna in hitra, je upravičeno pričakovati širšo vpeljavo celostne dvodimenzionalne analize in vrednotenja lipidov v veliko analiznih laboratorijih.
COBISS.SI-ID: 5728538
Navadno volčje jabolko (Physalis alkekengi L.) predstavlja bogat vir različnih biološko aktivnih sekundarnih metabolitov, zato obstaja potreba po detajlni karakterizaciji rastline. Nepolarni flavonoidni aglikoni predstavljajo ene redkih biološko aktivnih spojin v kutikularnih voskih rastline. Ločba flavonoidov je že obsežno pokrita v literaturi, toda metode namenjene ločbi in identifikaciji metiliranih flavonoidov so redke. V tej študiji smo razvili netarčni pristop za ločbo, izolacijo in identifikacijo metiliranih flavonoidov iz kutikularnih voskov rastline Physalis alkekengi L. var. franchetti. Hitra in enostavna ločba na HPTLC silikagelu je bila razvita za preliminarne presejalne analize flavonoidov. Razvili smo tudi hitri HPLC-UV-MSn in HPLC-UV metodi z uporabo C6-fenil oz. C18 stacionarne faze. V obeh primerih je bila za ločbo vseh preiskovanih spojin na bazni liniji ključnega pomena kombinacija temperature in tetrahidrofurana kot modifikatorja mobilne faze. Z uporabo semi-preparativnega analoga C18 stacionarne faze smo dosegli istočasno izolacijo neznanih spojin v čisti obliki. Z uporabo razvitih metod v kombinaciji z NMR smo detektirali in identificirali štiri 3-O-metilirane flavanole v kutikularnih voskih rastline Physalis alkekengi L. var. franchetti: miricetin 3,7,3’-trimetil eter, kvercetin 3,7-dimetil eter, miricetin 3,7,3’,5’-tetrametil eter in kvercetin 3,7,3’-trimetil eter. Razvita izokratska HPLC-UV-MSn metoda je hitra (analiza krajša od 8 min) in enostavna ter zato uporabna v kontroli kakovosti P. alkekengi L. var. franchetii, ker omogoča zajemanje kromatografskih odtisov eksternih metiliranih flavanolov. Podana razlaga mehanizma HPLC ločbe teh metabolitov predstavlja temelje za prihodnji razvoj kromatografskih metod za ločbo metiliranih flavonoidov in sorodnih spojin.
COBISS.SI-ID: 5867290
TLC-MS z on-line elucijo je sedaj dobro uveljavljena tehnika, vendar je kakovost dobljenih podatkov včasih ovirana z močnim ozadjem v MS spektru ali s supresijo ionov želenih spojin, zlasti kadar so uporabljene silikagelne plošče v kombinaciji s kislino v topilu za razvijanje. Ta problem smo rešili preprosto in učinkovito z dvema predrazvijanjema plošč: 1) metanol-mravljinčna kislina (10:1, v/v), 2) acetonitril-metanol (2:1, v/v). Z dvojnim predrazvijanjem smo dosegli izredno izboljšanje občutljivosti HPTLC-MS metod. Uporabnost tega pristopa smo potrdili z analizo flavan-3-olov in proantocianidinov v surovih ekstraktih rizoma japonskega dresnika (Fallopia japonica Houtt.). Ločbam na HPTLC silikagelnih in HPTLC silikagelnih MS ploščah razvitih s topili za razvijanje toluen-aceton-mravljinčna kislina (3:3:1, 6:6:1, 3:6:1, v/v) in diklorometan-aceton-mravljinčna kislina (1:1:0,1 v/v), je sledila post-kromatografska derivatizacija z detekcijskim reagentom na osnovi 4-dimetilaminocimetovega aldehida (DMACA). Test stabilnosti analitov na startu je potrdil, da je treba plošče razviti takoj po nanosu standardov in testnih raztopin vzorcev. Pri testiranju peturne stabilnosti po razvijanju, smo odkrili nepričakovan in še nepojasnjen pojav povečanja absorpcije pri 280 nm. Kljub temu, je test stabilnosti na osnovi post-kromatografske derivatizacije s 4-dimetilaminocimetovim aldehidom (DMACA) pokazal, da so analiti dovolj stabilni v časovnem intervalu potrebnem za HPTLC-MS analize. To je bilo pomembno za razvoj prvih HPTLC-MS in HPTLC-MSn metod za identifikacijo flavan-3-olov in B-tipa proantocianidinov od monomerov do dekamerov. V rizomih japonskega dresnika so bili s to metodologijo prvič identificirani: trimeri, trimer galati, tetramer galati, pentameri, pentamer galati, heksameri, heksamer galati, heptameri, oktameri, nonameri in dekameri. Poleg tega vse razvite HPTLC-MS metode omogočajo tudi hkratno identifikacijo stilbenov (resveratrol, picetanol heksozid, piceid) in antrakinonov (emodin, emodin-O-heksozid, emodin-O-(acetil)-heksozid in emodin-O-(6'-O-malonil)-heksozid). Razvita metodologija je primerna ne le za identifikacijo flavan-3-olov in proantocianidinov, ampak tudi za številne druge skupine farmakološko pomembnih spojin (flavonoidi, fizalini), ki so v svetu predmet številnih raziskav (nove spojine – biološka aktivnosti, nove surovine za zdravila, prehranska dopolnila).
COBISS.SI-ID: 6075930
Naredili smo primerjalno študijo različnih pristopov multivariatne analize slik kromatogramov rastlinskih smol kot reprezentativnih vzorcev s pestrim kemijskim profilom. Potrdili smo, da z uporabo kemometrijskih klasifikacijskih metod, uporabo zmogljivih naprav za zajem in obdelavo slike in algoritmov, z napredkom razvoja novih stacionarnih faz kot tudi različnih separacijskih postopkov, postaja profiliranje s HPTLC atraktivna in perspektivna tehnika na področju separacijskih znanosti.
COBISS.SI-ID: 6048282