Študirali smo kromatografsko separacijo desetih triterpenoidov (?-amirin, ß-amirin, ?-amirin, lupeol, lupenon, lupeol acetat, cikloartenol, cikloartenol acetat, ursolna kislina in oleanolna kislina) in dveh sterolov (stigmasterol in ß-sitosterol). Uporabili smo normalno fazno (silikagel) in reverzno fazno (C18 RP) tankoplastno kromatografijo (TLC) in C18 RP tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) z UV in masno spektrometrično (MS) detekcijo s kemijsko ionizacijo pri atmosferskem tlaku (APCI). Kot prvi smo uspeli ločiti izomerne triterpenole lupeol, ?-amirin, ß-amirin in cikloartenol z uporabo C18 RP-HPTLC plošč. Cikloartenol je mogoče ločiti od sorodnih spojin samo z uporabo C18 RP-TLC, ne pa s C18 RP-HPLC. ?-Amirin, ki smo ga izolirali iz ekstraktov kutikularnih voskov paradižnika, se loči od ostalih amirinov samo z uporabo HPLC. S pomočjo tandemske masne spektrometrije smo lahko razlikovali med izomeri lupeol, ?-amirin, ß-amirin, ?-amirin, cikloartenol in med lupeol acetatom ter cikloartenol acetatom. Z uporabo treh TLC in dveh HPLC metod lahko kvalitativno določimo vseh 12 spojin, kar je uporabno pri analizi teh spojin iz rastlinskih ekstraktov. Priporočeno je, da se TLC presejalne metode na silikagelu in C18 RP ploščah izvede pred HPLC analizo. ŠTEVILO CITATOV: 41 (vir: WoS), 49 (vir: WoS)
COBISS.SI-ID: 4217626
V povrhnjici korenin Echium italicum L. smo prvi identificirali devet šikoninskih pigmentov: šikonin (S), acetilšikonin (AS), propionilšikonin (PS), isobutirilšikonin (IBS), tigloilšikonin (TS), 3,3-dimetilakrilšikonin (DAS), angelilšikonin (ANS), 2-metil-n-butirilšikonin (MBS) in izovalerilšikonin (IVS). Razvili smo metodo na osnovi tankoplastne kromatografije, s katero je mogoče ločiti enantiomera šikonin in alkanin. S to metodo smo po saponifikaciji koreninskega ekstrakta potrdili prisotnost šikonina, ki smo ga v nadaljevanju zaestrili z različnimi acil kloridi in na ta način pridobili sedem standardnih spojin (vse razen ANS). Razvili smo analizno metodo na osnovi izokratske tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) z VIS in masno spektrometrično detekcijo, ki je omogočila, da smo prvi istočasno ločili vseh devet spojin s podobnimi strukturami, vključno s pozicijskimi in geometrijskimi izomeri, v kratkem času. Strukture petih najbolj zastopanih šikoninskih derivatov, izoliranih iz ekstrakta korenin z novo semi-preparativno HPLC metodo, smo dodatno potrdili z 1H in 13C spektri nuklearne magnetne resonance (NMR). Prvi smo objavili NMR spektre za AS in MBS. ŠTEVILO CITATOV: 28 (vir: WoS), 26 (vir: Scopus)
COBISS.SI-ID: 4134682
Šikonin in njegovi esterski derivati spadajo v skupino sekundarnih metabolitov, ki imajo širok spekter učinkov, ki blagodejno vplivajo na zdravje človeka. Kljub temu se šikonin uporablja predvsem v preparatih, ki temeljijo na oljni osnovi, zaradi slabe topnosti pigmenta v vodnih medijih, zato pozitivne lastnosti šikonina niso popolnoma izkoriščene. Nizka vodotopnost ima pogosto za posledico slabo biološko dostopnost in neprimernost šikonina za peroralno uporabo, poleg tega pa preprečuje njegovo širšo uporabo v živilski in farmacevtski industriji. Namen študije je bil povečati vodotopnost šikonina z dodatkom ß-laktoglobulina in okarakterizirati interakcijo med makromolekulo in ligandom s pomočjo spektrofotometrije, spektrofluorimetrije, tekočinske kromatografije visoke ločljivosti in masne spektrometrije. V prisotnosti ß-laktoglobulina se je vodotopnost šikonina povečala do 181-krat. Ena molekula šikonina se veže na ß-laktoglobulin kovalentno preko Cys 121, ostale molekule pigmenta pa se najverjetneje vežejo na protein preko nekovalentnih interakcij ŠTEVILO CITATOV: 8 (vir: WoS), 7 (vir: Scopus)
COBISS.SI-ID: 5114394
Primerjali smo separacijo strukturno podobnih inhibitorjev angiotenzin-konvertaze (lizinopril, cilazapril, ramipril in kvinapril ter njihove aktivne bikislinske oblike (prilati)) na konvencionalnih TLC silikagel 60 ploščah in na monolitnih ultra tankoplastnih kromatografskih (UTLC) ploščah. Pri uporabi UTLC plošč smo vpeljali tehnične modifikacije komercialno dostopne opreme za nanos vzorca, razvijanje in detekcijo. Plošče smo razvili v modificirani horizontalni kadi za razvijanje z uporabo topila za razvijanje v sestavi etil acetat-aceton-ocetna kislina-voda (4:1:0,25:0,5,v/v). Ločene spojine smo detektirali denzitometrično v načinu absorpcije/reflektance pri 220 nm in tudi s slikovno analizo po izpostavitvi plošče jodovim param. Rezultati kažejo, da je monolitna stacionarna faza bolj učinkovita pri separaciji strukturno podobnih polarnih spojin, kot so prilati, v primerjavi s konvencionalno silikagelno fazo. Identiteto spojin smo potrdili z ESI-MS po njihovi on-line ekstrakciji z UTLC in TLC plošč z uporabo Camagovega TLC-MS vmesnika. ŠTEVILO CITATOV: 26 (vir: WoS), 31 (vir: Scopus)
COBISS.SI-ID: 4647962
Pokazali smo, da je eden glavnih faktorjev pri direktnem določanju luteina v špinačnih ekstraktih ponovljiva in stabilna kromatografija. To smo dosegli z uporabo C30 kolone in mobilne faze v sestavi aceton-0,1 M trietilamonijev acetatni pufer pH 7 (TEAA) 9:1 (v/v). Izkoristek ekstrakcije luteina iz 10 mg liofilizirane špinače z 10 mL ekstrakcijskega topila (etanol, aceton, etanol-etil acetat 1:1 (v/v), metanol-THF 1:1 (v/v)) je bil vedno enak. Ekstrakcija je potekala 15 minut v dušikovi atmosferi z mešanjem. Izkoristek se je povečal, če smo k ekstrakcijskim topilom dodali 15 % 1 M TEAA pufra (pH 7). Z ovrednotenjem natančnosti smo pokazali, da med ekstrakcijo ne pride do izgub luteina (RSD ( 5 %, n=3). Z dodatkom 15 % TEAA k acetonu smo dosegli boljši izkoristek ekstrakcije tudi v primeru neliofilizirane špinače. Vsebnost luteina v različnih vzorcih špinače se je gibala od 5 do 15 mg/100 g sveže mase. Razvili smo prvo separacijo vseh karotenoidov in klorofilov na C18 "core-shell" koloni in z dodatkom 15 % TEAA acetonu izboljšali izkoristek ekstrakcije beta-karotena v primerjavi z ekstrakcijo z acetonom. ŠTEVILO CITATOV: 14 (vir: WoS), 15 (vir: Scopus)
COBISS.SI-ID: 5168410
Navadno volčje jabolko (Physalis alkekengi L.) predstavlja bogat vir različnih biološko aktivnih sekundarnih metabolitov, zato obstaja potreba po detajlni karakterizaciji rastline. Nepolarni flavonoidni aglikoni predstavljajo ene redkih biološko aktivnih spojin v kutikularnih voskih rastline. Ločba flavonoidov je že obsežno pokrita v literaturi, toda metode namenjene ločbi in identifikaciji metiliranih flavonoidov so redke. V tej študiji smo razvili netarčni pristop za ločbo, izolacijo in identifikacijo metiliranih flavonoidov iz kutikularnih voskov rastline Physalis alkekengi L. var. franchetii. Hitra in enostavna ločba na HPTLC silikagelu je bila razvita za preliminarne presejalne analize flavonoidov. Razvili smo tudi hitri HPLC-UV-MS/MS in HPLC-UV metodi z uporabo C6-fenil oz. C18 stacionarne faze. V obeh primerih je bila za ločbo vseh preiskovanih spojin na bazni liniji ključnega pomena kombinacija temperature in tetrahidrofurana kot modifikatorja mobilne faze. Z uporabo semi-preparativnega analoga C18 stacionarne faze smo dosegli istočasno izolacijo neznanih spojin v čisti obliki. Z uporabo razvitih metod v kombinaciji z NMR smo detektirali in identificirali štiri 3-O-metilirane flavonole v kutikularnih voskih rastline Physalis alkekengi L. var. franchetii: miricetin 3,7,3’-trimetil eter, kvercetin 3,7-dimetil eter, miricetin 3,7,3’,5’-tetrametil eter in kvercetin 3,7,3’-trimetil eter. Poleg tega je hitra in enostavna izokratska HPLC-UV-MS/MS metoda (analiza krajša od 8 min) uporabna v kontroli kakovosti P. alkekengi L. var. franchetii, saj omogoča zajemanje kromatografskih odtisov eksternih metiliranih flavanolov. V zaključku je tudi podana logična razlaga za mehanizem HPLC ločbe teh metabolitov. Ta tvori temelje za prihodnji razvoj kromatografskih metod za ločbo metiliranih flavonolov in sorodnih spojin. ŠTEVILO CITATOV: 12 (vir: WoS, Scopus)
COBISS.SI-ID: 5867290
Za karakterizacijo strukturno podobnih in kompleksnih farmakološko aktivnih fizalinov smo razvili prvi HPTLC in HPTLC–MS/MS metodi za njihovo določanje v neprečiščenih rastlinskih ekstraktih navadnega volčjega jabolka (Physalis alkekengi L.). Ločba na HPTLC silikagelnih ploščah, razvitih s topilom za razvijanje etil acetat–toluen–mravljinčna kislina (7:3:0.2, v/v), je omogočila denzitometrične presejalne analize fizalinov v načinu absorpcija-reflektanca, po derivatizaciji z detekcijskim reagentom z žveplovo kislino pa tudi v načinu fluorescenca-reflektanca. V primerjavi z obstoječimi (U)HPLC metodami omogoča HPTLC v tem primeru alternativno selektivnost, boljšo občutljivost in višjo ločljivost, kar smo ponazorili z ločbo standarda fizalina L in njegove nečistote, ki smo jo identificirali kot 2,3,25,27-tetrahidrofizalin A. Močno supresijo ionizacije analitov, ki je posledica uporabe kislinskega modifikatorja v topilu za razvijanje, smo učinkovito zmanjšali z uvedbo dveh zaporednih predrazvijanj plošč (1. metanol–mravljinčna kislina (9:1, v/v), 2. metanol). Tako smo znatno izboljšali občutljivost HPTLC–MS/MS metode, vendar pa je bila potrebna manjša modifikacija topila za razvijanje etil acetat–toluen– mravljinčna kislina (6:4:0.2, v/v). Uvedli smo inovativno sočasno sklopitev HPTLC z dvema različnima MS analizatorjema, in sicer s trojnim kvadrupolom in z ionsko pastjo, kar nam je omogočilo zanesljivo in nedvoumno ne-ciljano karakterizacijo fizalinov iz istega kromatografskega območja (lise) in določitev njihovih tipov. Uporabnost razvite HPTLC-denzitometrične in HPTLC–MS/MS metode smo potrdili z določanjem fizalinov v vodnih ekstraktih navadnega volčjega jabolka, pripravljenih z optimizirano hitro in enostavno ekstrakcijo pod refluksom. V različnih delih rastline P. alkekengi L., požete v različnih stopnjah zrelosti, smo odkrili razlike v profilih fizalinov, kar nakazuje na to, da niso vsi deli rastline ali rastlina kot celota primerni za specifično medicinsko uporabo. Za nadzor kakovosti rastline P. alkekengi L. so najbolj primerne povečane čaše, ker imajo spojine iz njih najbolj značilne MS/MS fragmentacijske vzorce z minimalnimi interferencami. ŠTEVILO CITATOV: 4 (vir: WoS, Scopus)
COBISS.SI-ID: 6255642
TLC-MS, ki temelji na eluciji spojin iz razvite HPTLC plošče, je zdaj že dobro uveljavljena tehnika, vendar pa velika intenziteta signalov v spektru adsorbenta (ozadja) ali pa supresija ionov lahko onemogočata izvedbo analiz, kadar se silikagelne plošče uporabljajo v kombinaciji s kislino kot modifikatorjem v topilu za razvijanje. Ta problem smo rešili preprosto in učinkovito z uporabo dveh zaporednih predrazvijanj plošč in sicer najprej s kombinacijo metanol-metanojska kislina (10:1, v/v), nato pa z acetonitril-metanol (2:1, v/v). S to rešitvijo smo dosegli bistveno izboljšanje občutljivosti HPTLC-MS metod. Uporabnost tega pristopa smo potrdili z analizami flavan-3-olov in proantocianidinov v ekstraktih rizomov japonskega dresnika (Fallopia japonica Houtt.). Separacijam na ploščah HPTLC silikagel in HPTLC silikagel MS čistote, ki so bile dosežene z uporabo topil za razvijanje toluen-aceton-metanojska kislina (3:3:1, 6:6:1, 3:6:1, v/v) in diklorometan-aceton-metanojska kislina (1:1:0,1, v/v), je sledila postkromatografska derivatizacija z detekcijskim reagentom na osnovi 4-dimetilaminocimetovega aldehida (DMACA). Z določitvijo stabilnosti analitov na startu smo potrdili, da je treba plošče razviti takoj po nanašanju standardov in testnih raztopin vzorcev. V petih urah testiranja stabilnosti po razvijanju smo odkrili nepričakovan pojav povečane absorpcije pri 280 nm. Na osnovi eksperimenta s postkromatografsko derivatizacijo z reagentom DMACA smo dokazali, da so analiti v časovnem okviru trajanja HPTLC-MS analiz dovolj stabilni. To je bilo pomembno za razvoj prvih HPTLC-MS in HPTLC-MS/MS metod za identifikacijo flavan-3-olov in B-tipa proanocianidinov od monomerov do dekamerov. Na podlagi razvite metodologije smo v rizomih japonskega dresnika prvi identificirali trimere, trimer galate, tetramer galate, pentamere, pentamer galate, heksamere, heksamer galate, heptamere, oktamere, nonamere in dekamere. Poleg tega so vse razvite HPTLC-MS metode omogočile tudi hkratno identifikacijo stilbenov (resveratrol, piceatanol heksozid, piceid) in antrakinonov (emodin, emodin-O-heksozid, emodin-O-(acetil)-heksozid in emodin-O-(6’-O-malonil)-heksozid). ŠTEVILO CITATOV: 10 (vir: WoS, Scopus)
COBISS.SI-ID: 6075930
Separacija in izolacija glavnih sirotkinih proteinov je že ekstenzivno pokrita v literaturi, toda v nobeni študiji niso bile uporabljene monolitne kolone. V naših raziskavah prvič predstavljamo uporabo kratkih monolitnih kolon (CIM – convective interaction media) za separacijo vseh glavnih sirotkinih proteinov in izolacijo ß-lactoglobulin variante A in B (ß-LgA in ß-LgB) iz komercialnega produkta – whey isolate (WI). Čeprav je bil glavni cilj študije poiskati primerno monolitno kolono in izbrati prave pogoje za čiščenje in izolacijo ß-LgA in ß-LgB, smo tekom študije razvili tudi tri dodatne analizne LC metode, pri čemer ima vsaka izmed njih potencialno aplikacijsko tarčo. Na monolitni dietilaminoetil CIM analitski koloni (CIMac DEAE) smo dosegli separacijo glavnih sirotkinih proteinov s postopnim zniževanjem pH vrednosti mobilne faze. Težko dosegljiv linearen eksterni pH gradient je bil linearen v pH območju 5,5-3 in razvita ionsko izmenjevalna tekočinsko kromatografska metoda visoke ločljivosti je bila primerna za sklopitev z masno spektrometrijo (MS). Zelo hitro separacijo sirotkinih proteinov z UV detekcijo smo dosegli v štirih minutah, z uporabo prototipa CIMac reverzno-fazne stiren-divinilbenzen (RP-SDVB) monolitne kolone. Prototip se je izkazal bolj učinkovit v primerjavi s polnjeno POROS perfusion kolono. Razvita RP-HPLC-MS metoda je hitra in lahko zaradi uporabe MS detektorja, nudi nižje meje zaznave in določljivosti. Na koncu smo razvili še »scale-up« metodo z uporabo 8 mL analoga prototipa CIMac RP-SDVB kolone za izolacijo nativnega in kemijsko nemodificiranega ß-LgA oz. ß-LgB iz WI, s stopnjo čistote višjo od 90 % oz. 81 % ter tako dosegli naš glavni cilj študije. Ta dva proteina sta bila nato naprej uporabljena v študijah interakcij med proteinom in ligandom. Razvite metode se odlikujejo v hitrosti analize, občutljivosti, ločljivosti in enostavnosti. Torej, prvič smo pokazali, da so kratke monolitne kolone uporabne za separacijo in izolacijo glavnih sirotkinih proteinov in da ima njihova uporaba nekaj očitnih prednosti. ŠTEVILO CITATOV: 11 (vir: WoS), 14 (vir: Scopus)
COBISS.SI-ID: 4909850
Sintezne konstrukcije, ki dopuščajo prostorsko in časovno omejeno organizacijo encimov v živih celicah predstavljajo obetavno post-translacijsko strategijo za nadzor pretoka informacij tako v metabolnih kot tudi signalnih poteh. V tem delu opisujemo uporabo plazmidne DNK kot stabilne, robustne in konfigurabilne konstrukcije za razvrstitev biosinteznih encimov v citoplazmi Escherichia coli. To je zahtevalo konverzijo individualnih encimov v po meri narejene DNK vezavne beljakovine s pomočjo genetske fuzije cinkove prstne domene, ki specifično vežejo unikatna DNK zaporedja. Pri izražanju v celicah, ki so nosile racionalno dizajnirane DNK konstrukcije z vsebujočimi cinkovimi vezavnimi mesti, smo dobili povišane titre različnih metabolnih produktov, vključno z resveratrolom, 1,2-propandiolom in mevalonatom. Tekom študije je bila razvita HPLC metoda, ki omogoča ločbo in kvantitativno določanje resveratrola, p-kumarne kisline in pterostilbena v teh specifičnih matricah. Ti rezultati poudarjajo uporabnost DNK konstrukcij za sestavljanje biosinteznih encimov v funkcionalne metabolne strukture. Poleg metabolomike predvidevamo, da so DNK konstrukcije uporabne pri sekvestraciji različnih tipov encimov za specificiranje proizvodnje bioloških signalnih poti ali za koordinacijo drugih proizvodnih procesov, kot so zvijanje proteinov, njihova degradacija in post-translacijske modifikacije. ŠTEVILO CITATOV: 121 (vir: WoS), 136 (vir: Scopus)
COBISS.SI-ID: 4824602