V zadnjih nekaj letih so izvencelični vezikli (eksosomi) postali zelo zanimivi širši znanstveni sferi zaradi njihovega velikega potenciala v diagnostiki in uporabi za terapevtske namene. Vendar je še vedno velik izziv določevanje njihove velikosti in števila, zaradi pomanjkanja zanesljivih karakterizacijskih tehnik. V tem delu smo se osredotočili na razvoj metode za ločevanje eksosomov po velikosti, karakterizacijo in kvantifikacijo eksosomov s pretočnim sistemom z asimetričnim prečnim pretokom (AF4), sklopljenim z več-detekcijskim sistemom (UV in MALS). Nefrakcionirane eksosome smo analizirali tudi z dinamičnim sipanjem svetlobe (DLS) in metodo sledenja nanodelcev (NTA), s katerima smo ocenili njihovo obliko, strukturo in številčno gostoto. Naši rezultati so pokazali, da prečni pretok in debelina kanala zelo vplivata na kvaliteto frakcionacije eksosomov. Manjši vpliv je bil opazen pri različnih časih fokusiranja. AF4/UV-MALS in DLS rezultati so pokazali, da sta v vzorcu prisotni dve populaciji, večji eksosomi in manjši, veziklom podobni delci, ki so se v AF4 eluirali skupaj z nečistočami. V primerjavi z DLS in AF4-MALS rezultati je NTA precenil velikost in številčno gostoto velikih eksosomov in podcenil populacijo manjših delcev.
COBISS.SI-ID: 5754138
Perforin (PFN) je eden izmed najpomembnejših efektorskih proteinov imunskega sistema. Proizvajajo ga citotoksični T limfociti in naravne ubijalske celice, in pomaga pri odstranjevanju tumorskih celic in celic okuženih z virusi. PFN je porotvorni protein, ki se učinkovito veže na lipidno membrano tarčne celice, kjer oligomerizira in tvori čez-membranske pore, ki omogočajo prehajanje ionov in drugih večjih molekul. Njegova karakterizacija je bila v preteklosti otežena zaradi pomanjkanja učinkovitih in zanesljivih ekspresijskih sistemov, s katerimi bi lahko dobili čisti in aktiven produkt. V tem delu smo predstavili optimizirano ekspresijo PFN z bakulovirusnim ekspresijskim sistemom. Optimizirali smo več parametrov ekspresije in čiščenja mišjega PFN (mPFN) in pokazali, da je dobljeni produkt čist, hemolitsko aktiven in da tvori pore na membranah K562 celic. Opazovali smo lahko tudi tvorbo okroglih por na liposomskih membranah s krio-elektronsko mikroskopijo. Naš protokol je odprl vrata za nadaljnje biokemijske in biofizikalne študije lastnosti PFN in njegove interakcije z manjšimi ligandi in lipidnimi membranami.
COBISS.SI-ID: 28754215
Pripravili smo emulzije z visokim deležem interne faze vode v ciklooktenu, ki smo jo stabilizirali s sorbitan monooleatom (SPAN 80). Emulzijo smo nato polimerizirali z metatezno polimerizacijo z odpiranjem obroča, pri čemer smo dobili popolnoma odprto makroporozno polimerno peno. Pri tem se je površinsko aktivna snov kovalentno vgradila v poli(ciklooktenske) verige preko reakcije prenosa verige.
COBISS.SI-ID: 37876997