Šikonin je lipofilna spojina, ki se nahaja v koreninah rastline Lithospermum erythrorhizon in jo zaradi raznovrstnih učinkov uporabljajo v tradicionalni kitajski medicini. Konkretno se uporablja za pospeševanje celjenja ran. Zanimalo nas je, ali so opaženi antipiretični in protivnetni učinki lahko posledica inhibicije inflamasoma NLRP3. Inflamasomi so multiproteinski kompleksi za aktivacijo kaspaze-1, slednja pa sproži zorenje vnetnih citokinov IL-1β in IL-18. Aktivacija inflamasoma NLRP3 poteka v dveh korakih. Šikonin inhibira tako prvi korak (aktivacijo NF-κB), kot tudi drugi korak, to je sestavljanje inflamasoma, ki ga povzročijo različni tipi aktivatorjev. Pokazali smo, da je v inhibiciji inflamasoma NLRP3 šikonin učinkovitejši kot acetilšikonin. Šikonin je inhibiral tudi aktivacijo inflamasoma AIM2 z dvoverižno DNA. Nadalje smo pokazali, da šikonin prepreči aktivacijo kaspaze-1 in deluje tudi direktno na kaspazo-1. Ker je šikonin preprečil tudi tvorbo agregatov adaptorja ASC, ki potekajo pred aktivacijo kaspaze-1, ugotavljamo, da lahko šikonin deluje na različnih stopnjah aktivacije inflamasomov. Pokazali smo tudi, da kompleksi šikonina z beta-laktoglobulinom ob manjši toksičnosti še vedno učinkovito inhibirajo aktivacijo inflamasoma, kar nakazuje, da so lahko oblike šikonina z izboljšano biološko uporabnostjo zanimive za terapevtske aplikacije v bolezenskih stanjih, ki jih povezujejo z inflamasomi.
COBISS.SI-ID: 5952026
Pretvorba prionskega proteina (PrP) je ključni dogodek pri prionskih boleznih, vendar pa je mehanizem tega procesa še vedno neznan. V študiji smo preučevali, kako na pretvorbo vplivajo patološke mutacije in sprememba pH. Pokazali smo, da patološke mutacije pospešijo pretvorbo. Raziskovali smo tudi vpliv pH in pokazali, da je za pretvorbo PrP ob znižanju pH ključna protonacija histidina 187. Če smo slednjega zamenjali za tirozinski aminokislinski ostanek, smo pretvorbo zelo upočasnili. Načrtali smo tudi dodatne histidinske ostanke, ki so imeli podoben vpliv kot H187 le, kadar so se nahajali na interakcijski površini med poddomenama, ne pa kadar so se nahajali na površini proteina. Opazili smo močno povezavo med stabilnostjo nativne strukture in kinetiko pretvorbe PrP. Naši rezultati demonstrirajo, da patološke mutacije olajšajo ločitev poddomen in nakazujejo, da bi bilo povečanje stabilnosti nativne strukture smiselna strategija pri razvoju novih terapij še neozdravljivih prionskih bolezni.
COBISS.SI-ID: 5610266
Oksidativni stres je univerzalen znak odziva na okužbo ali sterilno poškodbo in aktivira naravni imunski odziv. Ekstracelularni vezikli (EV) iz plazme bolnikov z revmatoidnim artritisom ali celic, ki so bile izpostavljene oksidativnemu stresu, aktivirajo TLR4/MD2 preko oksidiranih fosfolipidov (oxPL). EV iz zdravih oseb ali sintetično pripravljeni EV so bili spremenjeni v agoniste TLR4 z delno oksidacijo, hkrati pa je dolgotrajna oksidacija uničila aktivacijo TLR4. Poleg tega smo opredelili 15-lipoksigenazo kot nov encimski generator agonistov TLR4, ter pokazali, da so hidroperoksidirani PL endogeni agonisti TLR4. Aktivacija TLR4 z oxPL iz EV posnema molekularni mehanizem aktivacije TLR4 z lipopolisaharidom (LPS), kar smo pokazali z vlogo MD-2, mutacijami vezavnega mesta TLR4 in dimerizacijo receptorskega kompleksa. Vendar pa transkripcijski profil odziva BMDM-jev na patogeni signal (LPS) in endogeni signal nevarnosti (EV) ni dal enakega rezultata. Pri EV smo opazili komponento, ki vodi v prenehanje vnetja. Rezultati opredeljujejo EV kot oksidativni endogeni signal nevarnosti in potrjujejo zelo raznoliko vlogo receptorja TLR4.
COBISS.SI-ID: 5706266
Inflamasom je znotrajcelični multiproteinski kompleks, ki ga sestavljajo Nodu-podoben receptor (NLR), adapterski protein in kaspaza-1. Izmed receptorjev iz družine NLR je največ znanega o NLRP3. NLRP3 aktivira veliko različnih stimulusov, kot so mikrobni toksini in ATP in ostali endogeni signali npr. kristali natrijevega urata, ki se odlagajo pri putiki. Pokazali so, da tudi agregati Abeta, ki so glavna komponenta plakov pri Alzheimerjevi bolezni, aktivirajo NLRP3 v celicah mikroglije, kar privede do sproščanja IL-1b in nevrotoksičnosti. En glavnih produktov aktivacije inflamasoma NLRP3 je IL-1b, ki pomembno vpliva tudi na celjenje ran in druge regeneracijske procese. Čeprav je v zgodnjih fazah signaliziranje IL-1 koristno predvsem, kadar je ob okužbi potrebna aktivacija imunskega sistema, v kasnejših fazah pa zavira celjenje. Trenutno raziskujemo mehanizem sestavljanja inflamasoma in razvijamo nove načine inhibicije tega patološkega procesa, ki je skupen zelo različnim boleznim. Z namenom opredelitve domen NLRP3, ki sodelujejo pri zaznavanju aktivatorjev in pri oligomerizaciji smo pripravili 21 skrajšanih variant NLRP3 in jih izrazili v makrofagih, ki ne vsebujejo endogenega NLRP3. Pokazali smo, da so variante, ki ne vsebujejo C-končne LRR domene, polno odzivne na različne aktivatorje NLRP3 inflamasoma, tako topne kot delčkaste aktivatorje. Precej natančno smo določili skrajšan predel NLRP3, ki je še polno funkcionalen in ustreza nekaterim naravno prisotnim alternativnim variantam. Za krajše oblike smo pokazali, da ne podpirajo sestavljanja inflamasoma, vendar pa se še odzivajo na dodatek aktivatorjev. Testirali smo nekaj možnih mehanizmov aktivacije NLRP3 inflamasoma, tudi mehanizem, pri katerem oligomerizacijo sproži ena aktivirana molekula NLRP3, kot v primeru homolognega proteina NLRC4, vendar naši rezultati nakazujejo, da aktivacija NLRP3 ne poteka na enak način. Revizija rokopisa članka Hafner-Bratkovič* in sod. je v pripravi za Nature Communications. Z uporabo načrtovanih oligomerizacijskih domen smo pokazali, da je že trimerizacija domen PYD dovolj za robustno aktivacijo inflamasoma (Sušjan, Roškar in Hafner-Bratkovič*, BBRC, 2017). Sodelovali smo pri okarakterizaciji novih akrilatnih derivatov, ki inhibirajo NLRP3 ter so učinkoviti na modelu kronične vnetne črevesne bolezni (Cocco et al., J Med Chem, 2017).Na podlagi razpoložljivih struktur proteinov, ki sestavljajo inflamasom in modelov NLRP3 smo načrtovali dve skupini potencialnih inhibitornih peptidov. Pokazali smo, da peptidi inhibirajo aktivacijo kaspaze-1 in sproščanje IL-1β in IL-18 iz mieloidnih celic v odvisnosti od koncentracije. Poleg tega smo pokazali, da peptid specifično zavira aktivacijo inflamasoma NLRP3 in ne vpliva na druge inflamasome. Rokopis Sušjan, Lainšček & Hafner-Bratkovič* je pred oddajo. Rezultate smo predstavili v obliki posterjev in izbranih kratkih predstavitev na mednarodnih konferencah in srečanjih. Na to temo smo objavili tudi dva pregledna članka, vodja projekta pa je bila tudi povabljena, da skupaj s P. Pelegrinom napiše pregledni članek za ugledno revijo Current opinion in immunology, ki je bil sprejet v objavo. V povezavi z inflamasomom so bile zagovarjane tudi tri magistrske naloge, v delo pa sta vključena tudi doktorska študentka in magistrski študent.
COBISS.SI-ID: 6095642
Proteinske strukture nastajajo preko zapletenih medsebojnih interakcij gradnikov in še vedno nudijo izziv za načrtovanje proteinov de novo. V 2013 smo v Gradišar et al., Nat Chem Biol, 2013 predstavili strategijo načrtovanja samosestavljivih poliedrskih nanostruktur, ki temeljijo na modularnosti ortogonalnih dimerizacijskih segmentov. Ta platforma načrtovanja predstavlja osnovo za gradnjo proteinskih zvitij z novimi topologijami, pri čemer je osnova set ortogonalnih polipeptidnih segmentov, ki med seboj interagirajo. V študiji Ljubetič in sod., Nature Biotechnology, 2017 smo izboljšali dizajn nanokletk in uspešno pripravili tetraeder, štiristrano piramido in trikotno prizmo. Pokazali smo, da se takšne strukture lahko zvijejo in vivo, v bakterijah, sesalskih celicah in miših, kjer ne sprožijo aktivacije inflamasoma NLRP3 ter ne povzročajo ER stresa.
COBISS.SI-ID: 6266906