Katepsin L je cisteinska proteaza, podobna papainu, ki se izraža v vseh tipih celic in je vpletena v endosomalno razgradnjo proteinov. Izraža se v vseh tipih celic in igra pomembne vloge pri fizioloških in patoloških procesih kot so artritis, osteoporoza in rak. Da bi dobili boljši vpogled v mehanizem njegovega delovanja in posledično načrtovanja novih terapevtikov, smo v naši študiji poskusili razjasniti mehanizem specifičnosti katepsina L. Z namenom, da bi preučili interakcije katepsina L s sintetičnimi ligandi, smo pripravili nekativno mutanto katepsina L in jo kristalizirali. V nasprotju s pričakovanji smo iz strukture, ki smo jo razrešili pri ločljivosti 1.4 Å, ugotovili, da se molekula katepsina L cepi, in da je mesto cepitve ujeto v aktivnem mestu reže sosednje molekule. Zaradi tega je imela katalitična mutanta zelo nizko encimsko aktivnost.
COBISS.SI-ID: 29921831
V zadnjih nekaj letih so fotosintezne avtotrofne cianobakterije postale zanimive za biotehnološko uporabo, saj omogočajo trajnostno naravnano proizvodnjo metabolitov z visoko dodano vrednostjo. Čeprav ima problematika biološke varnosti velik vpliv na družbeno sprejemljivost biotehnologije, ki temelji na cianobakterijah, pa so vprašanja biološke varnosti genetsko spremenjenih cianobakterij večinoma še nenačeta. V naši raziskavi smo se odločili v modelno cianobakterijo Synechocystis sp. PCC 6803 vgraditi sisteme za biološko omejevanje širjenja. Varnostne sisteme smo v celice vnesli preko plazmidov. Osnovo je predstavljala nespecifična nukleaza NucA iz cianobakterije rodu Anabaena pod kontrolo različnih promotorjev, ki so se odzivali na kovinske ione. Inducirana celična smrt je bila posledica znotrajcelične razgradnje DNA, hkrati pa to preprečuje horizontalni prenos genov. Uspešno inducirano celično smrt smo dosegli s samomorilnim stikalom, ki ga je sestavljal gen nucA, pripet na varianto promotorja copM. Vzporedno s stikali na osnovi nukleaze smo pripravili tudi varnostna stikala na osnovi cianobakterijskih modulov toksin-antitoksin (TA). S prevezavo parov TA ssr1114/slr0664 in slr6101/slr6100 je bilo pod vplivom na kovine odzivnih promotorjev mogoče doseči upočasnitev rasti, ne pa tudi celične smrti. Kaže torej, da so celice sposobne obiti povišane ravni toksinov. Lastnosti promotorjev in učinkovitost translacije so vplivali na učinkovitost sistemov za biološko omejevanje. V kontekstu bioloških varnostnih naprav smo testirali več promotorjev, odzivnih na kovine, in izbrane promotorje, vključno z različico nsrB okarakterizirali z betagalaktozidaznim reporterskim testom.
COBISS.SI-ID: 1536856259
Programirana celična smrt pri večceličnih organizmih je usklajen in natančno uravnavan proces. Po drugi strani pa imamo zelo malo podatkov o tem, kakšno je omrežje molekul, ki pri bakterijah odelujejo v procesu odmrtja posamezne celice v populaciji ali odmrtju skoraj celotne populacije, kakor ga pogosto srečamo pri cvetenju cianobakterij. Nedavno odkritje, da je ortokaspaza MaOC1 cianobakterije Microcystis aeruginosa aktiven proteolitičen encim, je nakazalo možno razlago za vsaj eno od stopenj v procesu, slika pa še zdaleč ni popolna. Zanimivo je, da je v genomskem kontekstu MaOC1 umeščen v bližino več kopij genov, ki pripadajo modulom toksin-antitoksin. Za te obstaja domneva, da prav tako sodelujejo pri programirani celični smrti bakterij. Odkritje dveh sestavin, povezanih s celično smrtjo, v isti genomski regiji bi lahko odprlo nove poti k razjasnitvi mehanizmov, ki so osnova za celično smrt pri cianobakterijah.
COBISS.SI-ID: 1536816323
Legumain (AEP) je lizosomalna cisteinska proteaza. Prvič so jo okarakterizirali v semenih stročnic, kasneje pa so jo odkrili tudi pri višjih eukariotih. Ker je povečano izražanje AEP povezano s številnimi bolezenskimi stanji, kot so vnetje, ateroskleroza in tumorigeneza, bi lahko bila ta proteaza potencialno uporabna kot nov kemijski marker. V naši raziskavi smo s pomočjo hibridne kombinatorne knjižnice substratov (HyCoSuL) identificirali in testirali fluorogene substrate P1-Asp in z biotinom označene inhibitorje, ki so se vezali na legumain. Nekatere s to metodo identificirane probe so prepoznavale tudi kaspaze, zato smo, da bi zaobšli ta problem, uvedli nov pristop CoSeSuL, s katerim smo identificirali samo visoko-selektivne legumainske probe. Na koncu smo selektivnost teh orodij preverili tudi s testiranjem identificiranih prob na celicah M38L in HEK293. Naši rezultati so pokazali, da se metodologija CoSeSuL lahko uporablja kot osnovna metoda pri načrtovanju selektivnih prob tudi za druge družine proteaz, kjer je specifičnost težko doseči z konvencionalnim sekvenčnim profiliranjem.
COBISS.SI-ID: 29705767
Rastline in živali se proti patogenim mikrobom branijo preko znotrajceličnih receptorjev imunskega sistema, podobni domenam, ki oligomerizirajo ob vezavi nukleotidov (receptorji NLR). V naši raziskavi poročamo o v raztopini razrešeni strukturi N-terminalne domene z obliko ovite vijačnice iz proteina Sr33, ki je povezan z odpornostjo proti stebelni rji pri pšenici. Zanimivo je, da se ta struktura v precejšnji meri razlikuje od že objavljene kristalne strukture iste regije iz ortolognega proteina MLA10 iz ječmena, ki je odgovoren za odpornosti proti pepelasti plesni. Z uporabo strukturnih, biofizikalnih in funkcionalnih pristopov smo domeno Sr33 primerjali z drugimi domenami NLR z obliko ovite vijačnice, ki že imajo določeno strukturo. Naše delo redefinira trenutno razumevanje strukture in funkcije rastlinskih domen NLR z obliko ovite vijačnice, kar bo v prihodnje imelo signifikanten vpliv na študije tega pomembnega razreda zaščitnih receptorjev.
COBISS.SI-ID: 29922087