Peptidoglikan je ogromna molekula, ki gradi celično steno in obdaja bakterijske celice. Sestavljen je iz izmenjujočih se enot N-acetil glukozamina (NAG) in N-acetil muraminske kisline (NAM), ki so med seboj povezane preko ß-(1,4)-glikozidnih vezi, ter zamrežene s kratkimi polipeptidnimi verigami. Vse več bakterijskih sevov postaja odpornih proti antibiotikom v splošni uporabi, zato ciljanje proteinov, ki sodelujejo pri sintezi peptidoglikana, predstavljajo dobre potencialne tarče za razvoj novih terapij. Med njimi so tudi encimi, ki sodelujejo pri razgradnji peptidoglikana, kot so npr. N-acetil glukozaminidaze. Zato je bil znanstveni izziv naše študije preučiti, kako lizocimi oz. muramidaze, ki so do danes najbolj raziskani encimi, lahko razlikujejo med dvema glikozidnima vezema, ki se med sabo razlikujeta v zaporedju vendar pa sta kemično enakovredni v polimerih NAG-NAM. Kljub temu, da strukturne študije na lizocimu potekajo že več kot petdeset let, še vedno ni znano kako encim izbere vez, ki jo cepi. Z uporabo makromolekularne kristalografije, kemijske sinteze in molekularnega modeliranja smo v naši študiji pojasnili, kako ti dve skupini encimov, ki imata sicer enakovredno strukturno jedro, izkazujeta različno selektivnost do svoje tarče. Kristalna struktura N-acetil glukozaminidaze, autolizina E (AtlE) iz bakterije Staphylococcus aureus, same ali v kompleksu s fragmenti peptidoglikana, je namreč pokazala, da se N-acetil glukozaminidaze in muramidaze približajo glikozidni vezi substrata iz nasprotnih strani. Zato je lahko mesto prepoznavanja preostankov NAM v aktivnem mestu N-acetil glukozaminidaz dobra potencialna tarča za razvoj novih terapij.
COBISS.SI-ID: 30287911
Proteini bakterijske celične stene igrajo ključno vlogo pri preživetju in rasti celice ter interakcijah le-te z okoljem. Pri po Gramu pozitivnih bakterijah najdemo več vrst proteinov celične stene, ki so preko posebnih domen nekovalentno pritrjeni na spodaj ležeč peptidoglikan. Do sedaj je bila kristalna struktura določena samo enemu od dveh visoko ohranjenih modulov, ki proteine S-plašča sidrajo v celično steno, in sicer modula SLH. V naši študiji smo prvič dobili strukturni vpogled tudi v drugi modul, CWB2. Rešili smo kristalni strukturi dveh v S-plašču prisotnih proteinov, in sicer proteinov Cwp8 in Cwp6. Strukturi razkrivata zgradbo iz več domen ter strukturo modula CWB2, ki je skupen vsem 29 proteinom S-plašča pri bakteriji Clostridium difficile seva 630. Modul CWB2 ima obliko trikotnega trimera zgrajenega iz treh domen z zvitjem po Rossmann-u, ki razkriva tudi strukturno osnovo za pravilno zvitje modula, ki je potrebno za njegovo sidranje v celično steno. Primerjava v naši študiji pridobljenih podatkov z že objavljenimi rezultati atomske mikroskopije kaže, da je S-plašč bakterije C. difficile kompleksna oligomerna struktura, ki je po vsej verjetnosti sestavljena iz več različnih proteinov.
COBISS.SI-ID: 30263847
Katepsin L je cisteinska proteaza, podobna papainu, ki se izraža v vseh tipih celic in je vpletena v endosomalno razgradnjo proteinov. Izraža se v vseh tipih celic in igra pomembne vloge pri fizioloških in patoloških procesih kot so artritis, osteoporoza in rak. Da bi dobili boljši vpogled v mehanizem njegovega delovanja in posledično načrtovanja novih terapevtikov, smo v naši študiji poskusili razjasniti mehanizem specifičnosti katepsina L. Z namenom, da bi preučili interakcije katepsina L s sintetičnimi ligandi, smo pripravili nekativno mutanto katepsina L in jo kristalizirali. V nasprotju s pričakovanji smo iz strukture, ki smo jo razrešili pri ločljivosti 1.4 A, ugotovili, da se molekula katepsina L cepi, in da je mesto cepitve ujeto v aktivnem mestu reže sosednje molekule. Zaradi tega je imela katalitična mutanta zelo nizko encimsko aktivnost.
COBISS.SI-ID: 29921831
MAIN je interaktivna programska oprema za izvajanje kompleksnih nalog makromolekularne kristalografije. Z MAINom se lahko izvajajo postopki modifikacije elektronske gostote, manualno in polavtomatsko in avtomatsko grajenje in prenova molekularnega modela, računalniško fitanje molekularnih modelov v realnem in recipročnem prostoru, izračuni map elektronske gostote, in različne vrste validacij molekularne strukture. Trenutna dostopnost različnih analitskih orodij in vizualizacija molekul in map elektronske gostote omogočajo uporabniku učinkovito napredovati do zaključene strukture. Izredna globinska percepcija je dosežena z jasnostjo in kontrastom 3-dimenzionalnih objektov ter njihove gladke rotacije. MAIN omogoča sočasno delo na več molekularnih modelih v različnih kristalnih oblikah. Moč MAINa je v zmožnosti povprečenja map elektronske gostote in molekularnih modelov ob prisotnosti nekristalografske simetrije. Z MAINom se da optimirati parametre nekristalografske simetrije in mask in fitati strukturo na eksperimentalne podatke v eni ali več kristalnih oblikah.
COBISS.SI-ID: 26802727
Primerjava struktur je nakazala, da selektivnost interakcij med cisteinskimi katepsini in fragmentom p41 še zdaleč ni razumljena in zahteva nadaljnje raziskave. Pokazali smo, da fragment p41 inhibira tudi človeške katepsine V, K, F in najbrž tudi O in mišje katepsin L s Ki v nizkem nM območju. Inhibicija pa je bila pokazana tudi za katepsin S. Na podlagi teh spoznanj sklepamo, da je regulacija proteolitske aktivnosti večine cisteinskih katepsinov z fragmentom p41 pomemben in razširjen kontrolni mehanizem antigene prezentacije.
COBISS.SI-ID: 21555495
Preučevanje proteaz je v zadnjem desetletju doživelo velik razmah, predvsem zaradi hitrega razvoja novih tehnologij, kot so kvantitativna proteomika, razvoj metod za opazovanje procesov in-vivo ter obsežna uporaba in-vivo modelov. Ti so omogočili identifikacijo fizioloških substratov, hkrati pa je prišlo do premika paradigme od koncepta proteaz kot encimov, ki razgrajujejo proteine, do proteaz v smislu ključnih signalnih molekul. Kljub temu smo šele na začetku razumevanja signalnih poti proteaz. Zaenkrat smo identificirali le manjši set pravih fizioloških substratov za omejeno število proteaz, njihova fiziološka regulacija pa tudi še ni dobro pojasnjena. Podobno tudi povezave z drugimi signalnimi sistemi niso dobro poznane. V nadaljevanju bomo poudarili trenutne izzive v preučevanju proteaz.
COBISS.SI-ID: 25737767
Izpovprečene brcnjene (IB) mape se izračunajo iz molekularnih modelov, ki so pri vsaki mapi različno naključno premaknjeni v prostoru. Končne mape so nato seštete in normalizirane. Kot take so numerični analog map maksimalne verjetnosti. IB mape smo primerjali z uveljavljenimi računi map. Analiza je pokazala, da najbolj podobne mapam iz končnih modelov. Metodo so izzvali na težavnem primeru iz validacije struktur, kjer smo s pomočjo IB map razjasnili problematično regijo brez potrebe po prilagajanju atomarnega modela. Pokazali smo, da so mape lahko uporabne v vseh fazah določevanja struktur.
COBISS.SI-ID: 22793511
Mikocipini so inhibitorji cisteinskih proteaz, izolirani iz gob Clitocybe nebularis in Macrolepiota procera. Kristalne strukture klitocipina, makrocipina in klitocipina v kompleksu s katepsinom V so potrdile, da je inhibicija posledica doslej še neodkritega mehanizma. Vezava inhibitorja je povezana s spremembo konformacije peptidne vezi, do katere pride pred ali sočasno z vezavo inhibitorja. Mikocipini so s svojo sposobnostjo, da inhibirajo tri različne družine proteaz, dobro izhodišče za pripravo transgenih rastlin.
COBISS.SI-ID: 23263527
50 let je minilo od odkritja lisozoma. V obdobju, ki je sledilo, je bila hidrolitska mašinerija precej podrobno identificirana in karakterizirana. Med hidrolitskimi encimi so tudi cisteinski katepsini, člani družine papainu podobnih proteaz. Ti katepsini imajo edinstvene lastnosti reaktivnega mesta, po tkivih pa so neenakomerno izraženi. Njihova aktivnost v živih organizmih je v občutljivem ravnovesju izražanja, usmerjanja, aktivacije proencimske oblike, inhibicije s proteinskimi inhibitorji in razgradnje. Specifičnost njihovih aktivnih mest, nabor malih sintetičnih inhibitorjev in kristalnih struktur ponuja nova orodja za raziskave in razvoj. Njihova edinstvena reaktivna mesta omogočajo omejitve usmerjanja substanc zgolj z uporabo reaktivnih skupin. Uporaba epoksisukcinilnih inhibitorjev še prevladuje, vendar se zdi uporaba nitrilnih skupin trenutno najbolj ustrezna. Pogled na cisteinske katepsine kot lisozomalne proteaze se menja, saj so na voljo jasni podatki o njihovi lokalizaciji tudi v drugih celičnih predelih. Poleg tega, da so vključeni v presnovo proteinov, predstavljajo pomemben del endosomalne antigenske prezentacije. Poleg poznavanja neendosomalnih vlog katepsinov narašča tudi poznavanje njihovih vlog pri boleznih, kot sta na primer rak in revmatoidni artritis. Prav tako so katepsini pomembni regulatorji in signalne molekule pri mnogih fizioloških procesih. Trenutni izziv je identifikacija njihovih naravnih substratov z namenom da bi pridobili vpogled v poznavanje razgradnje substratov in njihovega mehanizma. V tem preglednem članku smo izpostavili napredek znanja na področju katepsinov v zadnjih desetih letih. Članek je posvečen Nobelovcu Christianu de Duveju, prav tako tudi celotna številka BBA Proteins and proteomics vol. 1824/1, 2012.
COBISS.SI-ID: 25347623
Predstavili smo prvi eksperimentalno osnovani opis lastnosti prokariontskega kaspaznega homologa, ki smo ga poimenovali ortokaspaza. Predvideni gen MaOC1 z zapisom za kaspazi podoben protein iz toksične cianobakterije Microcystis aeruginosa, znane kot povzročiteljice cvetenja jezer, smo izrazili v bakteriji Escherichia coli. Razjasnili smo način aktivacije proencima ter določili preferenčne aminokisline na mestu cepitve substrata. Z razliko od rastlinskih in živalskih kaspazam podobnih proteinov, ki potrebujejo za aktivacijo kalcij ali dimerizacijo, pri MaOC1 pride do avtoaktivacijske cepitve prekurzorja.
COBISS.SI-ID: 1536383427