Določanje specifičnosti proteaz je ključno za razumevanje njihovega delovanja. V ta namen smo razvili prvi proteomski pristop na osnovi separacije proteinov v gelu in ne potrebuje dodatnega označevanja (DIPPS-direktno profiliranje specifičnosti proteaz v gelu), ki omogoča hitro in zanesljivo določanje specifičnosti cepitev proteaz pri zelo različnih eksperimentalnih pogojih. Metoda temelji na ločbi celičnega proteome v gelu in njegove razgradnje s preiskovano proteazo v gelu. Cepljene peptide se odstrani iz gela z ekstrakcijo in identificira s pomočjo masne spektrometrije v kombinaciji z nespecifičnim dolžinsko-omejenim iskanjem po bazi podatkov. S to metodo smo uspešno profilirali 10 različnih proteaz od zelo specifičnih (tripsin, endoproteinaza GluC, kaspaza-7) do nespecifičnih (MMP-3, termolizin in katepsini K, L, S in V). Z uporabo DIPPS smo tudi uspešno profilirali termolizin pri njegovi optimalni temperaturi 75°C, kar je potrdilo široko uporabnost metode pri ekstremnih pogojih. Poleg tega smo z metodo DIPPS uspešno opravili prvo profiliranje legumaina vse do pH 4.0 in na ta način pokazali na sprremembo specifičnosti te proteaze v odvisnosti od pH, kar nadalje podpira široko uporabnost metode.
COBISS.SI-ID: 30654503
V tem članku smo z uporabo proteomskih metod pokazali, da katepsina L in S delujeta kot t.i. šedaze in odcepljata zunajceličnie domene adhezijskih proteinov iz družine CAM in transmembranskih receptorjev s površine rakavih celic. Pri miškah z izbitim genom za katepsin S z rakom pankreasa je bilo procesiranje nekaj od teh substratov bistveno zmanjšano, kar kaže na ključno vlogo katepsinov pri zunajceličnih cepitvah membransko vezanih proteinov. Poleg vpliva na migracijo in invazivnost tumorskih celic smo pokazali, da zunajcelični katepsini vplivajo tudi na znotrajcelično signalizacijo, kot smo pokazali za regulacijo Ras GTPase aktivnosti, s čimer smo pokazali na molekularni mehanizem povezav med aktivnostjo zunajceličnih katepsinov in napredovanjem raka.
COBISS.SI-ID: 28696103
V tem članku je podan opis enostavne in hitre metode za proteomsko profiliranje specifičnosti proteaz (fast profiling of protease specificity – FPPS), ki se lahko uporabi tudi na kompleksnih vzorcih. Identifikacija cepitvenih mest z označevanjem N-terminalnih peptidov temelji na tem, da se po tretmaju vzorca s testirano proteazo novonastale N-terminalne peptide označi z trideuteroacetilno skupino, kar omogoči njihovo ločitev od tripsinskih peptidov, ki nastanejo v kasnejši fazi priprave vzorca. Na ta način je z masno spektrometrijo mogoče natančno identificirati cepitveno mesto proteaze in tudi specifične preferenčne aminokisline, ki se v bližini cepitvenega mesta nahajajo. Metodo smo uspešno preverili na cisteinskih katepsinih K, L in S. dobljeni rezultati se tudi zelo dobro ujemajo z uveljavljeno metodo COFRADIC, kar potrjuje primernost metode.
COBISS.SI-ID: 28342823
V tem preglednem članku smo pripravili pregled trenutnega stanja na področju programirane celične smrti in vloge lizosomov. Še posebej smo se osredotočili na vlogo lizosomov in lizosomskih proteaz pri apoptozi in različnih oblikah programirane nekroze.
COBISS.SI-ID: 30354983
Katepsin B je lizosomska cisteinska proteaza, ki se med razvojem tumorja specifično preusmeri na površino tumorskih celic in v zunajceličnino. V tem delu opisujemo razvoj biokompatibilnih liposomskih nanoprenašalcev, LNC-NS-629, na katere je pripet specifičen inhibitor katepsina B. Ex vivo in in vivo študije so potrdile, da LNC-NS-629 selektivno cilja tumorske celice in celice strome, ki nanodelce selektivno internalizirajo. S tem pristopom smo potrdili, da ciljanje katepsina B predstavlja zelo obetaven pristop k diagnosticiranju in zdravljenju raka.
COBISS.SI-ID: 27932455