Izraz epigenetika označuje preučevanje mehanizmov, ki vplivajo na izražanje genov na stabilen in potencialno deden način, ne da bi se ob tem spremenilo zaporedje DNA. Ti mehanizmi vključujejo posttranslacijske histonske modifikacije, z miRNA posredovano posttranskripcijsko regulacijo in metilacijo DNA. Akumulacijo napak v molekuli DNA tekom časa, kar vodi vsaj v določeni meri do spremembe normalnih epigenetskih vzorcev, pogosto povezujejo s staranjem. Epigenetski procesi veljajo za pomembne mehanizme, preko katerih okoljski in stohastični stresorji pospešujejo razvoj številnih patologij pri ljudeh. Glede na to lahko pričakujemo, da je epigenetski vpliv na številne večfaktorske kompleksne bolezni, ki se razvijejo kasneje v življenju, kot sta osteoporoza in osteoartritis, močan. Osrednja točka vseh skeletnih patologij je deregulacija kostne prenove, ki poteka pod vplivom osteoblastov, ki gradijo kostnino, in osteoklastov, ki jo razgrajujejo. Da sta oba proces uravnotežena, morajo biti aktivnost, diferenciacija in apoptoza obeh tipov celic strogo nadzorovane. Diferenciacijo osteoblastov in osteoklastov spremljajo velike spremembe v izražanju genov. Pokazali so, da deacetilacija histonov in metilacija DNA negativno regulirata izražanje številnih genov, ki so povezani z različnimi stopnjami diferenciacije osteoblastov. Vendar pa številne miRNA tudi pospešujejo osteoblastogenezo. Poleg tega bi lahko bile mutacije v miRNA kodirajočih regijah, ki povzročijo inaktivacijo, povezane s patogenezo osteoporoze. Cilj tega preglednega članka je osvetliti vlogo epigenetskih mehanizmov v kostni prenovi in homeostazi, da bi prepoznali njihov diagnostični in terapevtski potencial pri skeletnih boleznih.
COBISS.SI-ID: 3604593
Točnost teknik, kot so analiza mikromrež, reverzna transkripcija in kvantitativni PCR in vsetranskriptomsko sekveniranje, je močno odvisna od kakvosti RNA. Po tripsinizaciji, ki je rutinski postopek za odleplanje adherentnih celičnih linij, smo v več poskusih opazili obsežno razgradnjo RNA. V študiji smo raziskali vzroke za to degradacijo in poiskali alternativne postopke, ki omogočajo izolacijo intaktne RNA, visoke kakovosti. Več različni celičnih linij smo pred izolacijo RNA disociirali iz podlage s tripsinizacijo in več drugimi postopki. Preučevali smo prispevek eksogenih ribonukleaz ali indukcijo endogenih ribonukleaz s proteazami v tripsinskem reagentu na razgradnjo RNA. Pri tripsinizaciji je prišlo do popolne degradacije RNA, ne glede na celično linijo, stopnjo diferenciacije ali številko pasaže. To se je zgodilo, ko se je intaktna RNA inkubirala neposredno s tripsinom in bila zavrta v inhibirajo aktivnostjo tripsinskih proteaz. Preprečevanje razgradnje s tretiranjem tripsinskega reagenta z natrijevim hipokloritom je razkrilo prisotnost ribonukleaz v tripsinu, ki izvira iz živalske trebušne slinavke. Če se ne moremo izogniti encimski disociaciji celic pred izolacijo RNA, je za izolacijo visoko kakovostne RNA nujna direktna liza celic z regentom na osnovi fenola in gvanidina ali uporaba disociacijskega proteaznega regenta, ki ne izvira iz živali.
COBISS.SI-ID: 3690865
Gilbertov sindrom je ena najpogostejših presnovnih bolezni pri ljudeh, za katero je značilna nekonjugirana hiperbilirubinemija, ki je posledica zmanjšane aktivnosti encima, ki konjugira bilirubin - UDP-glukuronoziltransferaze (UGT1A1). Čeprav je Gilbertov sindrom običajno precej benigna motnja, je genotipizacija UGT1A1(TA)n pomembna za izključitev resnejših vzrokov hiperbilirubinemije, zato ima analiza velik pomen v personalizirani medicini. Cilj naše študije je bil oblikovati plazmide kot referenčni material, ki bi ga lahko uporabili pri genotipizaciji UGT1A1(TA)n. Plazmide smo pripravili z rekombinantno DNA tehnologijo, število ponovitev pa smo pripravili kot tudi celotno zaporedje pa smo potrdili s sekvenciranjem po Sangerju. Ustreznost referenčnega materiala je bila preizkušena s kapilarno elektroforezo in denaturacijsko tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti. Plazmidi vsebujejo vse 4 alele (TA)5, (TA)6, (TA)7 in (TA)8, ki jih najdemo v človeški populaciji, prav tako pa smo uspešno pripravili tudi plazmid (TA)4 ponovitvami. Pripravljeni referenčni material nam omogoča pripravo vseh možnih genotipov polimorfizma UGT1A1(TA)n in nam služi kot ustrezen nadomestek za humani genomski DNA referenčni material pri rutinski genotipizaciji in razvoju novih postopkov genotipizacije.
COBISS.SI-ID: 3644273