Zunajcelični vezikli, kot so npr. eksosomi, so zaradi velikega potenciala za uporabo v klinični diagnostiki in terapevtiki, postali izredno zanimivi za širšo znanstveno srenjo. Kljub temu predstavlja natančna karakterizacija velikosti populacije veziklov in njihova kvantifikacija velik izziv, saj zanesljive tehnike še niso razvite. V tej študiji smo postavili metodo za ločevanje eksosomov glede na velikost in njihovo karakterizacijo in kvantifikacijo z ločevanjem s pretočnim sistemom na katerega deluje asimetrični prečni pretok in detekcijo s sipanjem svetlobe pri več kotih in UV detektorjem (AF4/UV-MALS). Izvedli smo tudi analizo neločenih eksosomov z DLS (dinamičnim sipanje svetlobe) in NTA (ang. nanoparticle tracking analysis) tehnikama in sklepali na njihovo obliko, notranjo strukturo in njihovo koncentracijo. Rezultati so pokazali, da imata asimetrični prečni pretok in debelina kanala pomemben vpliv na kvaliteto ločevanja eksosomov, čas fokusiranja pa nima močnega vpliva. Rezultati AF4/UV-MALS in DLS kažejo na prisotnost dveh subpopulacij veziklov, to so večji eksosomi in manjši veziklom podobni partikli, ki so se ko-eluirali s proteinskimi nečistočami. V primerjavi z DLS in AF4/UV-MALS rezultati, NTA tehnika precenjuje velikost in koncentracijo veziklov pri večji eksosomski populaciji, detektira pa tudi manjšo populacijo veziklov.
COBISS.SI-ID: 5754138
Nedavne raziskave so pokazale, da vse preučevane telesne tekočine vsebujejo številne zunajcelične vezikle (ZV), ki v premeru merijo od 30 – 1000 nm. Ti vezikli so obdani s fosfolipidno membrano, ki vsebuje mikrodomene, kot so rafti in kaveole. Glavni podskupini teh ZV-jev so eksosomi (70-150 nm v premeru), ki nastanejo v endosomalnem sistemu, in mikrovezikli (100-1000 v premeru), ki se formirajo z uvihavanjem plazemske membrane. Te nanovezikle sprošča večino celičnih tipov in imajo pomembno vlogo v medcelični komunikaciji v fizioloških in patofizioloških pogojih. Ker ZV-ji vsebujejo »podpis« materinske celice, so bili za številne bolezni predlagani kot biomarkerji. Zaradi njihove fiziološke funkcije, so bili ZV-ji nekaterih izbranih celičnih tipov uporabljeni tudi kot terapevtski agensi za imunoterapijo, vakcinacijo, regenerativno medicino in za prenos zdravil. To hitro razvijajoče področje bazičnih in aplikativnih raziskav ZV-jev bo v prihodnje pomembno vplivalo na biomedicino. V tem članku, bomo znanstveniki, ki izhajamo iz kliničnega, akademskega in industrijskega področja, in smo se mrežili preko akcije COST: European Network on Microvesicles and Exosomes in Health and Disease (ME-HAD), zagovarjali in pokazali velik potencial ZV-jev tako za diagnostično kot terapevtsko področje nanomedicine.
COBISS.SI-ID: 5001579
Astrociti v možganih zagotavljajo metabolno in prehranjevalno podporo nevronom. Nepravilnosti pri delovanju homeostaze, ki je odvisna od astrocitov, lahko prispevajo k začetku in nadaljevanju raznih bolezni, vključno z Alzheimerjevo boleznijo (AD), za katero je značilna izguba nevronov v časovnem obdobju več let. Raziskali smo, ali astrociti iz modela miši za AD v presimptomatski fazi kažejo znake bolezni v obliki sprememb mobilnosti mešičkov, izločanja peptidov in purinergične signalizacije s kalcijem. V kulturi astrocitov izoliranih iz miši divjega tipa (WT) in miši 3xTg-AD, smo označili sekretorne mešičke in kisle endosome oz. lizosome. Označevalec je bil atrijski natriuretični peptid, označen z zelenim fluorescenčnim proteinom (ANP.emd). Označevalec je bil tudi LysoTracker. Znotrajcelično koncentracijo kalcija ([Ca 2+]i) smo spremljali s Fluo-2 in merili s konfokalno mikroskopijo. Spontane mobilnosti mešičkov, označenih z ANP in z LysoTracker so se v primerjavi s kontrolami v astrocitih 3xTg-AD zmanjšale. Dolžina trajektorija (TL), največji premik (MD) in indeks usmerjenosti (DI) so bili zmanjšani v peptidinih mešičkih in endosomih/lizosomih (p (0,001). Enako zmanjšanje smo izmerili tudi pri mobilnosti mešičkov, ki so bile stimulirane z ATP. Podobno zmanjšanje mobilnosti mešičkov smo opazili pri podganjih astrocitih WT, ki smo jih transficirali z mutiranim presenilinom 1 (PS1 M146V). Z ATP stimulirana sekrecija ANP iz posameznih mešičkov je manj izražena pri 3xTg-AD in pri PS1 M146V v primerjavi z WT (P (0,05). Purinergična stimulacija je povzročila dvofazne in oscilirajoče koncentracije kalcija; slednje so bile manj pogoste (P (0,001) v 3xTg-AD astrocitih. Izražanje PS1 M146V v astrocitih zmanjšuje mobilnosti mešičkov in zmanjšuje stimulirano izločanje signalnih molekul ANP; kar lahko prispeva k razvoju Alzheimerjeve bolezni.
COBISS.SI-ID: 32251353
Zunajcelični vezikli so heterogena populacija membranskih veziklov s pomembno vlogo v medcelični komunikaciji, ki so iz celic v zunajcelični prostor sproščeni tako in vivo kot tudi in vitro. Izolirali so jih iz raznolikih bioloških vzorcev kot so kri, bronhoalveolarni izpirek, sinovialna tekočina, urin, plodovnica, sperma, mleko, slina; ter iz kultur večine tipov sesalčjih celic. Glede na velikost in mesto nastanka v celici, zunajcelične vezikle ločimo na eksosome (30–100 nm), mikrovezikle (100–1.000 nm) in apoptotska telesca (1.000–5.000 nm). Njihova proteinska, nukleinska (miRNA) in lipidna sestava odseva sestavo celice izvora in je odvisna od trenutnega stanja celice. Posledično so zunajcelični vezikli postali pomemben vir novih biooznačevalcev za raznolika telesna stanja s pomembno diagnostično in prognostično vrednostjo, še posebno za bolezni centralnega živčevja. Raziskave potekajo tudi v smeri ciljanja zunajceličnih veziklov z zdravili za preprečevanje razvoja bolezni, njihove uporabe kot terapevtsko sredstvo ali kot dostavni sistem za zdravilne učinkovine, pri čemer se znanstveniki srečujejo s številnimi preprekami. Ravno zaradi velikega kliničnega potenciala, se je zanimanje za karakterizacijo, nastanek in vlogo zunajceličnih veziklov v zadnjih letih močno povečalo, pri čemer je prišlo tudi do pomembnega napredka pri razvoju metod za njihovo izolacijo in analizo. V tem preglednem članku bomo opisali vrste zunajceličnih veziklov in metode za njihovo izolacijo in analizo, ter njihovo biološko vlogo in klinični potencial.
COBISS.SI-ID: 32578521
Proteini Nef vseh lentivirusov primatov, vključno z virusom opičje imunske pomankljivosti šimpanzov (SIVcpz), pozitivno vplivajo na infektivnost produciranih virusov. Vendar lastnost Nef-a, ki je vpletena v povečanje infektivnosti, še vedno in popolnoma razumljena. Kljub temu so bile dosedanje študije funkcije Nef-a virusa SIVcpz večinoma izvedene v kontekstu provirusa HIV-1. V želji, da bi preučili vlogo Nef-a v replikacijskem ciklu virusa SIVspz, smo z vpeljavo mutacije v unikatno restrikcijsko mesto znotraj zaporedja nef pripravili derivat klona SIVcpzWTGab2, ki je defektiven za Nef. Omenjen klon izraža na 74-aminokislin skrajšan N-terminalni peptid Nef, ki smo ga poimenovali SIVcpz-tNef. Ugotovili smo, da se SIVcpz-tNef ne obnaša tako, kot se obnašajo klasični nef-deletirani kloni HIV-1 ali SIV opic (SIVmac). Zanimivo so bili potomci SIVcpz-tNef iz okuženih celičnih linij Hek-293T in Molt popolnoma neinfektivni. Ta izguba infektivnosti SIVcpz-tNef je korelirala z inhibicijo procesiranja Gag in GagPol. Opazili smo hkratno povečano akumulacijo Gag-a in zmanjšano raven reverzne transkriptaze v virusnih lizatih. Opažanja so se ponovila tudi v primeru okužbe celic z SIVcpzΔnef ali HIV-1wt s hkratnim izražanjem tNef peptida, kar nakazuje, da je skrajšan peptid dominantno negativen za virusno procesiranje in infektivnost tako za SIVcpz kot za HIV-1. Pokazali smo, da skrajšan peptid Nef veže GagPol zunaj proteazne regije, s čimer najverjetneje že v zgodnji stopnji blokira procesiranje prekurzorjev GagPol in Gag. Ta študija je prvič pokazala, da bi naravno prisotni peptidi Nef lahko blokirali procesiranje in infektivnost lentivirusov.
COBISS.SI-ID: 33120985