Članek se osredotoča na analizo mehanizmov vnosa genov z metodo elektroporacije (gensko elektrotransfekcijo), ki se je v zadnjih letih izkazala za obetavno, od virusov neodvisno metodo vnosa plazmidne DNA; oligonukleotidov in kratkih RNA molekul. Predstavili smo nove eksperimentalne in teoretične rezultate analize različnih korakov v procesu elektrotransfekcije pritrjenih celic in celičnih suspenzij, podkrepljene s teoretično analizo relevantnih biofizikalnih procesov. V in vitro študiji smo se dotaknili odprtih vprašanj tega procesa: kako je elektropermeabilizacija povezana z učinkovitostjo elektrotransfekcije; kakšna je vloga elektroforeze DNA za kontakt in prenos čez membrano; vizualizirali in teoretično analizirali smo interakcije med DNA in membrano ter njihovo vlogo pri učinkovitosti transfekcije ter določili razlike med pritrjenimi in suspendiranimi celicami. Uporabili smo različne kombinacije visokonapetostnih in nizkonapetostnih pulzov. Pokazali smo, da je ključni korak vstavitev DNA v elektropermeabilizirano membrano, ki je pod vplivom elektroforetične sile. Vstavljena DNA se nato počasi prenese v citosol, od koder je le še vstop v jedro omejujoči dejavnik transfekcije. Kvantifikacija in teoretična analiza ključnih parametrov je pokazala, da število molekul DNA, ki interagirajo z elektropermeabilizirano membrano, narašča z naraščajočo koncentracijo DNA ali z dodatnimi elektroforetskimi nizkonapetostnimi pulzi poleg visokonapetostnih. Kljub temu transfekcija doseže zasičenje, kar namiguje da se lahko uspešno prenese le določeno število molekul DNA. Razlike med transfekcijo pritrjenih in suspendiranih celic razložimo z bolj homogeno velikostjo, obliko in gibanjem suspendiranih celic. Na podlagi predstavljenih rezultatov sklepamo, da se DNA najverjetneje prenese preko stabilnih elektropor ali preko elektro-stimulirane endocitoze, ki je odvisna od parametrov pulzov. Razumevanje razmerij med permeabilizacijo, elektroforezo, viabilnostjo in učinkovitostjo transfekcije lahko pomaga pri hitrejši optimizaciji protokolov električnih pulzov za specifične aplikacije. Published in Scientific Reports NPG: A'', IF=5.08 http://www.nature.com/scientificreports
COBISS.SI-ID: 10952788
Experimentalno in teoretično smo pokazali pomen interakcije DNA z membrano ter korelacijo z učinkovitostjo genske elektrotransfekcije. Raziskava je bila opravljenja v sodelovanju s ksupino iz Francije, vodja dr. M.P. Rols, CNRS, Tolouse. Kot prvi smo tudi sistematično primerjali različne protokole električnih pulzov za gensko elektrotransfekcijo: dolge pulze (nekaj ms), kratke pulze (nekaj 100 mikros) in kombinacije visokonapetostnih HV in nizkonapetostnih LV pulzov. Hkrati smo analizirali učinkovitost transfekcije, preživetje in kvantificirali interakcijo z membrano. Pokazali smo, da za aplikacije in vivo in v kliniki je bolj primerno uporabiti nabore dolgih pulzov ali kombinacij HV+LV pulzov,saj tako dosežemo največjo učinkovitost. V primeru, ko pa je viabilnost ključnega pomena je bolj primerno izbrati nabore krajših setov pulzov saj omogočajo boljše preživetje celic.
COBISS.SI-ID: 9897812
Dosedaj še ni popolnoma jasen mehanizem prehoda DNA v citoplazmo pri genski elektrotransfekciji, ena izmed hipotez pa je elektro-stimulirana endocitoza. Razvili smo protokol, ki omogoča vizualizacijo endocitoze po dovajanju električnih pulzov. Pokazali, da lahko opazujemo temeraturne odvisne spremembe endocitoze ter opazujemo proces znotraj celične vesikulacije pri izpostavitvi stresu. Ugotovili smo da ni povečanja endocitoze po izpostavitvi električnim pulzom, ki jih uporabljamo za elektrotransfekcijo. Naši rezultati kažejo, da je pravilna hipoteza o translokaciji DNA čez hidrofilne pore v lipidnem dvosloju, kar je pomembno za nadaljnje študije elektrotransfekcije.
COBISS.SI-ID: 8747092
Razvili smo prvi "multiscale model" elektroporacije tkiva. Do sedaj so obstajale ali rešitve na »bulk« nivoju tkiva kjer so lastnosti tkiv opisane samo z efektivno prevodnostjo ali pa rešitve za elektroporacijo (formiranje por v membrani) na nivoju posamezne celice, vodja projketa pa je pred tem objavila povezava med eno in več celicami za statični primer. V tem članku smo dinamično rešitev za vsiljeno transmembransko napetost in permabilizacije na posamezni celici preko 3D numeričnega modela sklopili s sistemov več celic, tako da lahko opazujemo efektivne lastnosti – kot je efektivna prevodnost, delež permabiliziranih celic in časovna dinamika na bolj realnem »tkivnem« modelu. Določili smo odvisnost deleža elektroporiranih celic of polja ter pokazali, da je po prehodnem pojavu elektoporacija trenuten proces. Model omogoča razširitev na specifično tkivo, saj vsebuje celice realnih oblik in porazdelitev po velikosti.
COBISS.SI-ID: 9058388
Transfekcija primarnih humanih mioblastov omogoča raziskave mehanizmov, kis o pomembni za regeneracijo mišic in gensko terapijo mišičnih bolezni. Za raziskave smo izbrali kulturo primarnih humanih mioblastov, saj se te celice na dani razvojni stopnji še vedno delijo, kar je lahko prednost za gensko terapijo. Genska terapija je močno terapevtsko orodje, katerega aplikativnost pa je omejena z nizko učinkovitostjo tehnik za vnos genov. Primerjali smo dve metodi transfekcije: lipofekcijo in elektroporacijo. Metodi smo optimizirali s sistematičnim prilagajanjem parametrov in analizo učinkovitosti transfekcije in celične viabilnosti. V kulturo mioblastov smo vnašali plazmid pEGFP-N1 bodisi z Lipofektaminom 2000 ali elektroporacijo. Učinkovitost transfekcije in celična viabilnost sta obratno sorazmerni pri obeh metodah. Pri elektroporaciji smo optimirali parametre pulzov tako, da smo dobili tako maksimalno učinkovitost transfekcije kot tudi maksimalno viabilnost. Naši poskusi so pokazali, da ja nabor parametrov, ki to omogočajo, zelo ozek. Prekratki pulzi (8 × 200 µs) niso povzročili prenosa genov, predolgi (8 × 10 ms) pa so močno zmanjšali viabilnost celic. Optimizacijo smo tako izvedli s pulznimi protokoli 8 × 2 ms in 8 × 5 ms. Najboljše rezultate smo dobili s protokolom 8 × 2 ms 8 kV/cm pulzi (44% transfekcija, 74 % viabilnost). Visoko učinkovitost transfekcije smo dobili tudi v drugih poracijskih medijih (iso-KPB, SMEM, RPMI), nizka transfekccija v DMEM in MEM mediju pa je bila posledica vsoke koncetracije kalcija (1,8 mM), ki negativno vpliva na viabilnost in s tem na učinkovitost elektrotransfekcije. Celokupna učinkovitost transfekcije (% živih transfeciranh celic) je bila pri optimalnih protokolih za lipofekcijo (32 %) in elektroporacijo (32,2 %) primerljiva. Obe metodi sta tako primerljivo učinkoviti za vnos genov v primarne humane mioblaste, kljub temu pa ima elektroporacija nekatere prednosti pri in vivo aplikacijah na skeletne mišice.
COBISS.SI-ID: 28284967