Pri nekaterih imunsko pogojenih boleznih centralnega živčnega sistema imajo pomembno vlogo astrociti, ki izražajo poglavitni histokompatibilnostni kompleks MHC razred II, predvsem ob izpostavljenosti interferonu-gama. Raziskali smo mobilnost mešičkov, ki vsebujejo MHC pri miših divjega tipa in pri miših brez intermediarnih filamentov. Ugotovili smo, da lahko astrociti z mobilnostjo specifičnih mešičkov uravnavajo delovanje antigen predstavitvene vloge astrocitov v možganih. Eden ključnih znotrajceličnih procesov je promet celičnih organelov, ki je temelj usklajenega in intergiranega delovanja celic na katerem temelji pridelava in izločanje celici lastnih in/ali rekombinantnih proteinov. Kljub hitro rastočemu tehničnemu napredku, ki omogoča naprednejše pristope za vpogled v znotrajcelično mobilnost organelov, ti še vedno niso uporabljeni kot metode za analizo pato/fizioloških stanj celic v terapevtskih in industrijskih procesih. Ena od lastnosti astrocitov je tudi, da lahko prevzamejo vlogo »neprofesionalnih« antigen predstavitvenih celic (APC), ki za razliko od profesionalnih APC (kot so dendriti, makrofagi, B-celice) na celični membrani ne izražajo molekul poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (»major histocompatibility complex«, MHC) razreda II konstitutivno, ampak le ob izpostavljenosti citokinu interferonu gama. V splošnem igrajo APC ključno vlogo pri imunskem odzivu. Njihova naloga je privzem eksogenih antigenov in predstavitev le-teh CD4 pozitivnim T-celicam pomagalkam, kar privede do aktivacije teh celic. APC privzemajo in procesirajo antigene prek procesa endocitoze. V centralnem živčnem sistemu so astrociti aktivirani z interferonom (IFN-gama) vključeni v predstavitev antigenov in aktivacijo CD4 pozitivnih T-celic pomagalk in tako sodelujejo pri nevroloških motnjah povezanih z imunskim odzivom, kot je multipla skleroza. V ta namen uporabljamo mikroskopsko platformo, ki vključuje in vitro celične sisteme, metode in standard za manipulacijo in/ali analizo znotrajcelične mobilnosti celičnih organelov. Te raziskave lahko omogočijo odkrivanje novih terapevtskih tarč za zdravljenje nevroloških motenj, kot so travme, mentalna zaostalost, kognitivni primanjkljaj, nevrodegeneracijske bolezni, vnetja, nevrološki sindrom pri visokih tlakih (HPNS) in drugo. Specifičnost naše platforme je kombinacija pristopov, ki obsegajo: metodo spremljanja dinamike znotrajceličnih organelov za iskanje biološko aktivnih substanc (npr. sestavine serumov, cerebrospinalne tekočine ter druge biološko aktivne anorganske ali organske molekule in njihove mešanice), metodo za določanje kakovosti celic za napredne celične terapije in metodo za ocenjevanje in nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov znotraj evkariontskih celic v povezavi z mobilnostjo znotrajceličnih organelov.
COBISS.SI-ID: 3272561
Astrociti v možganih signalizirajo sosednjim celicam tako, da z uravnavano eksocitozo izločajo kemične prenašalce (prenašalce glije). Recentne raziskave so razkrile potencialno vlogo signalnih lipidov kot domnevnih modulatorjev uravnane eksocitoze. Raziskali smo vpliv sfingozina in strukturnega analoga fingolimoda/FTY720, ki so ga recentno odobrili za zdravljenje multiple skleroze, na: (i) mobilnost mešičkov in (ii) sproščanje vsebine mešičkov iz astrocitov v kulturi. Različne tipe mešičkov, peptidergične, glutamatergične in endosome/lizosome, smo fluorescentno označili s transfekcijo celic s plazmidom, ki kodira zapis za atrijski natriuretični peptid označen z mutirano zeleno fluorescentno beljakovino in glutamatni prenašalec membrane mešičkov označen z zeleno fluorescentno beljakovino ali z barvilom LysoTracker. Mobilnost mešičkov v citoplazmi in v sloju ob bazalni plazmalemi smo opazovali s konfokalnim mikroskopom in mikroskopsko tehniko popolnega notranjega odboja fluorescence (TIRF). Sfingozin in FTY720, ne pa tudi nepermeabilni lipidni analogi, sta dozno-odvisno zmanjšala mobilnost mešičkov v različnih subceličnih predelih in izrazito zavrla izzvano sproščanje sekrecijskih peptidov in glutamata. Zaključujemo, da permeabilni, sfingozinu podobni lipidi vplivajo na uravnavano eksocitozo tako, da atenuirajo mobilnost mešičkov in preprečujejo njihov učinkovit dostop/interakcijo z mesti sidranja/zlitja na plazmalemi.
COBISS.SI-ID: 30039513
GTPazi Rab4 in Rab5 igrata ključno vlogo pri uravnavanju eksocitoze. Navkljub intenzivnim preteklim raziskavam je nejasna njuna vloga v uravnavanju mobilnosti mešičkov. V astrocitih, najpogostejšem tipu celic glije v možganih, mešički kažejo neusmerjeno in usmerjeno mobilnost, ki se lahko občasno spremeni, čeprav mehanizem sprememb ni pojasnjen. S kvantitativno analizo mikrografij smo raziskali dinamiko premikov mešičkov v realnem času v astrocitih, ki so bili transfecirani z različnimi GDP- in GTP-zakljenjenimi mutantami Rab4 in Rab5. Z lokalizacijo Rab4 in Rab5 na zgodnjih in poznih endosomih, smo določili domnevno velikost mešičkov s tem, da smo izmerili površino fluorescentnih posnetkov mešičkov in ugotovili mobilnost mešičkov v astrocitih divjega tipa in astrocitih transfeciranimi z mutantami Rab. Dominante negativne in dominantne pozitivne mutante, Rab4 S22N, Rab5 S34N in Rab4 Q67L, Rab5 Q79L, so povzročile povečanje navidezne velikosti mešičkov, še posebej mutante Rab5. Transfekcija z mutantami Rab je značilno zmanjšala mobilnost mešičkov, zlasti dolžino poti, največji odmik na prepotovani poti in hitrost. Dodatno smo opazili značilno zmanjšanje deleža mešičkov, ki kažejo usmerjeno mobilnost v celicah transfeciranih z Rab4 S22N, Rab4 Q67L, Rab5 S34N in Rab5 Q79L. Naši podatki kažejo, da spremembe GDP-GTP preklopov ne vplivajo le na dogodke zlivanja mešičkov med endocitozo in recikliranjem, temveč tudi na molekulske interakcije, ki določajo usmerjeno mobilnost mešičkov in verjetno vključujejo motorne beljakovine ter citoskelet.
COBISS.SI-ID: 29424345