Holesterol je ključni element bioloških membran, vendar njegov vpliv na eksocitozo še ni povsem pojasnjen. Poskusi z metilbetaciklodekstrinom (MCD), ki povzroci deplecijo holesterola v membranah smo pokazali, da deplecija holesterola rezultira v znižanani pojavnosti eksocitoze. Z uporabo specifičnih inhibitorjev endocitoze (Dyngo 4a) smo pokazali, da je omenjeni vpliv MCD na eksocitozo specifičen in ni posledica zmanjšane endocitoze.
COBISS.SI-ID: 30562009
Pomemben intermediat pri eksocitozi predstavlja fuzijska pora. Na eksocitozo, in tudi fuzijsko poro, pomembno vpliva dvig znotrajcelične koncentracije kalcija. Tudi ostali sekundarni obveščevalci, kot npr. cAMP vplivajo na eksocitozo, njihov vpliv na fuzijsko poro pa ni znan. Z našimi poskusi smo pokazali, lahko s specifičnimi inhibitorji in aktivatorji sinteze cAMP in analogi cAMP vplivamo na sproščanje hormona prolaktina iz laktotrofov, ki ta hormon sintetizirajo. Z visokoločljivostnimi meritvami membranske kapacitivnosti pa smo pokazali, da se vpliv cAMP na eksocitozo odraža tudi na ravni posameznega mešička, in sicer prek spremenjenih lastnosti fuzijske pore. cAMP stabilizira fuzijskepore in s tem prehodni tip fuzije in mešičkom prepreči popolno zlitjo s plazemsko membrano.
COBISS.SI-ID: 30620889
Poznamo popolno in prehodno eksocitozo, ki sta prevladujoči obliki eksocitoze v melanotrofih in laktotrofih. Sfingozin vpliva na eksocitozo tako, da aktivira protein VAMP2 za združevanje kompleksa SNARE. Ugotovili smo, da sfingozin in strukturni homolog fingolimod povišata raven eksocitoze tako, da povišata frekvenco prehodne in popolne fuzije. Pri tem so prešli mešički z večjim premerom v popolno fuzijo, manjši mešički pa so se zlivali s plazemsko membrano prehodno. Rezultati so pokazali, da je za od sfingozina odvisno eksocitozo, poleg ostalih dejavnikov, pomembna tudi velikost mešičkov.
COBISS.SI-ID: 30722265
Fuzijska pora je lahko pomemben dejavnik za uravnavanje sproščanja hormonov in živčnih prenašalcov. Domneva se, da je fuzijska pora v začetni fazi ozka in stabilna, pozneje pa se razširi in omogoči popolno zlitje mešička s plazmalemo. Namen raziskave je bil preveriti vpliv proteinov SecI/Munc18 na lastnosti fuzijske pore z lektrofiziološko metodo spremljanja membranske kapacitivnosti v majhni krpici membrane. V izolirane podganje laktotrofe smo vnesli mutante Munc18-1, ki vplivajo na vezavo tega proteina s sintaksinom1 (R39C), proteinom Rab3A (E466K) in proteini Mint (P242S). V primerjavi s celicami, ki so izražale le nativni protein Munc18-1, je Munc18-1 E466K povečal frekvenco fuzijskih dogodkov in podaljšal povprečni odprti čas fuzijske pore. Munc18-1 P242S je podaljšal povprečni odprti čas fuzijske pore. Vse mutante so stabilizirale fuzijsko poro v začetni fazi. Posledica vnosa mutant Munc18-1 je bilo tudi zlivanje večjih mešičkov, ki pa najverjetneje niso bile posledice sestavljene fuzije, kar smo potrdili z mikroskopijo STED. Mikroskopija na atomsko silo je pokazala, da vezava Mun18-1 na t.i. zaprto obliko sintaksina1 prepreči vezavo sintaksina1 na sinaptobrevin2 kar prepreči sidranje mešička. V kolikor je sintaksin1 že vezan na protein SNAP25, Munc18-1 ne prepreči vezave s sinaptobrevinom2. Ena od vlog Munc18-1 je torej zagotavljanje sidranja mešičkov prek vezi sintaksin1-SNAP25-sinaptobrevin2, ki je stabilnejša od vezi sintaksin1-sinaptobrevin2. Munc18-1 pa se veže tudi na kompleks sintaksin1-SNAP25-sinaptobrevin2, kar omogoči uravnavanje fuzijske pore.
COBISS.SI-ID: 28521433
Za študij eksocitoze in endocitoze so nujne neposredne meritve tega procesa. Eleganten način predstavlja spremljanje membranske kapacitivnosti, ki je sorazmerna s spremembami v površini plazemske membrane. Do sprememb v površini plazemske membrane pride v procesih ekso in endocitoze. V tem članku natančno opišemo protokol za meritve membranske kapacitivnosti. Ta protokol navadno uporabljamo za meritve na izoliranih hipofiznih celicah, se ga pa da enostavno prilagoditi kateremkoli drugemu tipu celic. Časovno potratna je predvsem postavitev sistema, izvajanje meritev pa je po tem, ko operater dobi nekaj izkušenj, hitra in relativno enostavna.
COBISS.SI-ID: 30613977