Predloženi izum predstavlja platformo, ki vključuje in vitro celične sisteme, metode in standard za manipulacijo in/ali analizo znotrajcelične mobilnosti celičnih organelov, pomembne za razumevanje temeljnih celičnih procesov kot tudi za uporabo celic v medicinske in biotehnološke namene. Novost predloženega izuma je kombinacija pristopov, ki obsegajo: i) metodo spremljanja dinamike znotrajceličnih organelov za iskanje biološko aktivnih substanc (npr. sestavine serumov, cerebrospinalne tekočine ter druge biološko aktivne anorganske ali organske molekule in njihove mešanice), ii) metodo za določanje kakovosti celic za napredne celične terapije in iii) metodo za ocenjevanje in nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov znotraj evkariontskih celic v povezavi z mobilnostjo znotrajceličnih organelov. Ta izum predstavlja tudi podlago za proučevanje učinkov različnih farmacevtskih učinkovin za zdravljenje/modulacijo nekaterih patoloških stanj, ki zadevajo medcelično komunikacijo ter s tem povezano mobilnost in dinamiko znotrajceličnih organelov.
F.21 Razvoj novih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov
COBISS.SI-ID: 29542617Astrociti s sproščanjem glijotransmiterjev pomembno vplivajo na modulacijo prenosa signala v kemičnih sinapsah med nevroni. Regulirana eksocitoza, ki je v astrocitih eden izmed mehanizmov sproščanja glijotransmiterjev, vključuje fuzijo membrane mešička s plazmalemo. Mešiček, katerega membrana se spoji s plazmalemo, tvori t.i. fuzijsko poro, prek katere se z difuzijo izločijo molekule iz lumna mešička v zunajcelični prostor. Ko fuzijska pora nastane, se ta lahko zapre ali pa se povsem integrira v plazmalemo. V prvem primeru se površina plazmaleme poveča le prehodno, ob popolni fuziji pa se površina poveča za daljši čas. Neposredne meritve fluktuacije plazmaleme zaradi uravnavane eksocitoze v astrocitih doslej še niso bile izvedene. Spremembe v površini celične membrane smo merili elektrofiziološko, z metodo vpete napetosti krpice membrane, v konfiguraciji pritjene celice (ang. cell-attached patch-clamp membrane capacitance measurement). S spremljanjem reverzibilnih in ireverzibilnih diskretnih skokov v kapacitivnosti membrane (parameter, ki je linerano povezan s površino membrane) smo sklepali, kakšen je bil mehanizem eksocitoze; ali je bila fuzija prehodna ali popolna. Rezultati so pokazali, da v astrocitih v kulturi več kot 90 % dogodkov predstavlja prehodno fuzijo. V spontanih pogojih prevladujejo dogodki z amplitudami kapacitivnosti mešičkov 0,41 ± 0,06 fF (premer sekretornih mešičkov okoli 100 nm) in s fuzijskimi porami, ki so povprečno odprte 91 ± 6 ms. Stimulacija z adenozin trifosfatom (ATP) pomembno vpliva na fiziologijo astrocitov. Rezultati kažejo, da se po stimulaciji astrocitov z ATP (1 mM) poveča frekvenca prehodnih fuzijskih dogodkov, katerih amplituda je v povprečju 0,41 ± 0,01 fF. Poleg teh dogodkov smo opazili tudi skupino dogodkov, ki so imeli povprečje amplitud kapacitivnosti mešičkov 1,50 ± 0,03 fF in predstavljajo populacijo sekretornih mešičkov s premeri okoli 300 nm. Ti mešički imajo daljši povprečni čas odprtja fuzijske pore, v primerjavi z mešički, ki imajo manjši premer (0,27 ± 0,01 s proti 0,16 ±0,01 s). Fuzijska pora se po stimulaciji z ATP razširi, kar omogoča pospešeno sproščanje glijotransmiterjev.
D.10 Pedagoško delo
COBISS.SI-ID: 35338245Sproščanje hormonov in živčnih prenašalcev lahko omejuje fuzijska pora, ki je v začetni fazi ozka in stabilna, pozneje pa se razširi in omogoči popolno zlitje mešička s plazmalemo. Vloga proteinov SecI/Munc18 pri fuziji še ni raziskana. Z lektrofiziološko metodo spremljanja membranske kapacitivnosti v majhni krpici membrane izoliranih laktotrofe smo spremljali vpliv mutant Munc18-1, ki vplivajo na vezavo tega proteina s sintaksinom1 (R39C), proteinom Rab3A (E466K) in proteini Mint (P242S). V primerjavi s celicami, ki so izražale le nativni protein Munc18-1, je Munc18-1 E466K povečal frekvenco fuzijskih dogodkov. Munc18-1 E466K in P242S sta podaljšali povprečni odprti čas fuzijske pore. Vse mutante so stabilizirale ozko fuzijsko poro in povzročile zlivanje večjih mešičkov, ki pa niso bile posledice sestavljene fuzije, kot so pokazali rezultati mikroskopije STED. Mikroskopija na atomsko silo je pokazala, da vezava Mun18-1 na zaprto obliko sintaksina1 prepreči vezavo sintaksina1 na sinaptobrevin2 kar prepreči sidranje mešička. Če je sintaksin1 že vezan na protein SNAP25, Munc18-1 ne prepreči vezave s sinaptobrevinom2. Ena od vlog Munc18-1 je torej zagotavljanje sidranja mešičkov prek vezi sintaksin1-SNAP25-sinaptobrevin2, ki je stabilnejša od vezi sintaksin1-sinaptobrevin2. Uravavanje fuzijske pore s strani Munc18-1 poteka prek vezave na kompleks SNARE (sintaksin1-SNAP25-sinaptobrevin2).
F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference)
COBISS.SI-ID: 28841433