Poznamo dva tipa eksocitoze, popolno in prehodno, prva je prevladujoča oblika v melanotrofih, ki so zato primerni za merjenje celokupne eksocitoze. Sfingolipid sfingozin aktivira protein VAMP2 za združevanje kompleksa SNARE, ki je pomemben v membranski fuziji. Ugotovili smo, da sfingozin, kot tudi njegov strukturni homolog fingolimod povišata eksocitozo, če ju dodamo zunajcelično. Nadalje smo preverili eksocitozo v laktotrofih, kjer je prevladujoč tip prehodna eksocitoza. Eksocitozo smo spremljali tako, da smo merili diskretne spremembe membranske kapacitivnosti, ki je sorazmerna spremembam v površini plazmaleme. V prisotnosti sfingozina se je frekvenca prehodne in popolne fuzije povišala. Mešički z večjim premerom so prešli v popolno fuzijo, medtem ko so manjši mešički ostali ujeti v prehodni eksocitozi. Označevanje s fluorescentnimi protitelesi, ki prepoznajo prolaktin (PRL) je pokazalo, da je bil povprečni premer izločene a nerazgrajene vsebine mešičkov večji kot premer neizločenih mešičkov. S pomočjo protiteles, ki prepoznavajo hormon PRL in VAMP2 smo ugotovili, da je intenziteta signala VAMP2 neodvisna od premera PRL mešičkov, hkrati pa je bila gostota VAMP2 signalov manjša v večjih mešičkih. Rezultati kažejo, da s sfingozinom posredovana uravnavana eksocitoza ni povezana samo s številom kompleksov SNARE na posameznem mešičku, ampak je odvisna tudi od velikosti mešičkov, ki lahko pomembno vplivajo na prehod iz prehodne v popolno eksocitozo.
D.09 Mentorstvo doktorandom
COBISS.SI-ID: 784247Monomerne GTPaze RAB uravnavajo mobilnost mešičkov in delujejo kot molekulska stikala. Vloga proteinov RAB pri transportu mešičkov v astrocitih, ki so najštevilčnejše celice glije v možganih, je slabo raziskana. Vpliv proteinov RAB smo razisklovali z vnosom plazmidne DNA, ki kodirajo divji tip, dominantno-negativne in dominantno-pozitivne mutacije, ki vplivajo na GTPazno aktivnost proteinov RAB4A in RAB5A. Preverili smo tudi prisotnost in vlogo proteinov GDI1 in GDI2. Naši rezultati so pokazai, da sta RAB4A in RAB5A prisotna na znotrajceličnih strukturah zgodnje in pozne endocitoze. Vnos dominantno-negativnih in dominantno-pozitivnih oblik proteinov RAB v astrocite povzroči navidezno povečanje mešičkov, kar je posebej očitno v primeru vnosa dominantno-pozitivnih oblik proteinov RAB5A. Mutante vplivajo na mobilnost mešičkov, in sicer tako, da mobilnost upočasnijo in zmanjšajo delež mobilnih mešičkov. Pokazali smo, da astrociti izražajo efektorska proteina GDI1 in GDI2. Zmanjšanje izražanja teh dveh proteinov pomembno vpliva na mobilnost mešičkov v podganjih astrocitih.
D.09 Mentorstvo doktorandom
COBISS.SI-ID: 262313984Astrociti s sproščanjem glijotransmiterjev vplivajo na prenosa signala med nevroni. Pomembno vlogo ima regulirana eksocitoza in eden izmed ključnih intermediatov - fuzijska pora. Z neposrednimi meritvami fluktuacij plazmaleme smo spremljali, kakšen je bil mehanizem eksocitoze; ali je bila fuzija prehodna ali popolna. Rezultati so pokazali, da v astrocitih v kulturi več kot 90 % dogodkov predstavlja prehodno fuzijo. V spontanih pogojih prevladujejo dogodki z amplitudami kapacitivnosti mešičkov 0,41 ± 0,06 fF (premer sekretornih mešičkov okoli 100 nm) in s fuzijskimi porami, ki so povprečno odprte 91 ± 6 ms. Stimulacija z adenozin trifosfatom (ATP) pomembno vpliva na fiziologijo astrocitov. Rezultati kažejo, da se po stimulaciji astrocitov z ATP (1 mM) poveča frekvenca prehodnih fuzijskih dogodkov, katerih amplituda je v povprečju 0,41 ± 0,01 fF. Poleg teh dogodkov smo opazili tudi skupino dogodkov, ki so imeli povprečje amplitud kapacitivnosti mešičkov 1,50 ± 0,03 fF in predstavljajo populacijo sekretornih mešičkov s premeri okoli 300 nm. Ti mešički imajo daljši povprečni čas odprtja fuzijske pore, v primerjavi z mešički, ki imajo manjši premer (0,27 ± 0,01 s proti 0,16 ±0,01 s). Fuzijska pora se po stimulaciji z ATP razširi, kar omogoča pospešeno sproščanje glijotransmiterjev.
D.10 Pedagoško delo
COBISS.SI-ID: 35338245Predloženi izum predstavlja platformo, ki vključuje in vitro celične sisteme, metode in standard za manipulacijo in/ali analizo znotrajcelične mobilnosti celičnih organelov, pomembne za razumevanje temeljnih celičnih procesov kot tudi za uporabo celic v medicinske in biotehnološke namene. Novost predloženega izuma je kombinacija pristopov, ki obsegajo: i) metodo spremljanja dinamike znotrajceličnih organelov za iskanje biološko aktivnih substanc (npr. sestavine serumov, cerebrospinalne tekočine ter druge biološko aktivne anorganske ali organske molekule in njihove mešanice), ii) metodo za določanje kakovosti celic za napredne celične terapije in iii) metodo za ocenjevanje in nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov znotraj evkariontskih celic v povezavi z mobilnostjo znotrajceličnih organelov. Ta izum predstavlja tudi podlago za proučevanje učinkov različnih farmacevtskih učinkovin za zdravljenje/modulacijo nekaterih patoloških stanj, ki zadevajo medcelično komunikacijo ter s tem povezano mobilnost in dinamiko znotrajceličnih organelov.
F.06 Razvoj novega izdelka
COBISS.SI-ID: 29542617Visokoločljivostna mikroskopija je napredna tehnologija, kjer dosežemo ločljivost, ki je vsaj dvakrat boljša od ločljivosti običajne svetlobne mikroskopije. Organizacija srečanja, ki je spremljal uradni začetek mikroskopije STED v Sloveniji. Eden od ključnih instrumentov visokoločljivostnih mikroskopij predstavlja mikroskop STED, ki ga imamo sedaj tudi v Sloveniji. Mikroskop STED, ki je sestavljen iz najbolj naprednih optičnih, mehanskih in električnih komponent, predstavlja instrument, ki omogoča meritve na meji danosti. Mikroskop STED omogoča vizualizacijo živih celic z ločlivostjo med 35 in 40 nm, v idealnih pogojih pa okoli 30 nm. Znanstveno srečanje z delavnico visokoločljivostne mikroskopije je bilo namenjeno predstavitvi tovrstne mikroskopije.
B.01 Organizator znanstvenega srečanja
COBISS.SI-ID: 2814543