Prionske bolezni so smrtne nevrodegenerativne bolezni ljudi in živali. Normalna oblika prionskega proteina se pretvori v patološko agregirano obliko PrPSc, katere strukture ni mogoče raziskovati s strukturnimi tehnikami visoke resolucije. Odločili smo se, da bomo različne predele prionskega proteina omejili z disulfidnimi mostički in tako opredelili njihovo vlogo pri strukturni pretvorbi. Pri večini mutant smo opazili povečano termično stabilnost, pa so se kljub temu učinkovito pretvorile v fibrilarno obliko. Samo disulfidi, ki so povezali poddomeni B1-H1-B2 in H2-H3 so onemogočili strukturno pretvorbo in vitro in v celičnih modelih prionskih bolezni. Če smo te disulfidne mostičke z redukcijo porušili, so se mutante učinkovito pretvorile, kar nakazuje, da je ločitev poddomen nujen korak pri strukturni pretvorbi prionskega proteina. Pripravili smo tudi mutante, pri katerih so bili enojni cisteini uvedeni tako, da bi tvorili z disulfidom povezane dimere le v primeru dimera z izmenjavo domen, kar smo tudi eksperimentalno dokazali. V nasprotju s predhodnimi modeli PrPSc, ki predvidevajo, da pride do pretvorbe obstoječih elementov sekundarne strukture, smo pokazali, da je velika večina le-teh ohranjenih. Predhodne študije so že nakazale, da je dimerizacija stopnja, ki določa hitrost fibrilizacije PrP, mi pa smo pokazali, da sta ločitev in izmenjava poddomen znotraj strukturirane domene nujni za pretvorbo in predlagamo mehanizem, pri katerem pred amiloidogenezo najprej nastane dimer z izmenjavo domen, ki bi lahko bil pomembna stopnja za inhibicijo strukturne pretvorbe.
COBISS.SI-ID: 4602394
Prionske bolezni so usodne nevrodegenerativne bolezni, ki so lahko pridobljene, sporadične ali dedne. Pri približno eni tretjini patoloških mutacij se zamenja aminokislinski ostanek za bolj hidrofobnega, zato nas je zanimalo, kako ojačanje hidrofobnih interakcij v pod-domeni H2-H3 vpliva na pretvorbo prionskega proteina. V mišji prionski protein smo uvedli tri točkovne hidrofobne mutacije. Človeška patološka mutacija V209I ni vplivala na stabilnost in fibrilizacijo PrP, medtem ko sta dizajnirani mutaciji V175I and T187I povečali termično stabilnost PrP. Mutanta V175I je fibrilizirala hitreje kot protein divjega tipa. T187I se je pretvarjala počasneje, vendar pa je bila intenziteta fluorescence za amiloide specifičnega barvila tioflavina T signifikantno višja. Z virusno transdukcijo smo pripravili tudi celične linije, ki so izražale te mutante in jih izpostavili mišjim prionom seva 22L. Celice, ki so izražale V209I so slabo podpirale propagacijo prionov, medtem ko so V175I, T187I in protein divjega tipa učinkovito pretvarjali v obliko, odporno proti razgradnji s proteinazo K (PrPRes). Podobno kot pri fibrilizaciji in vitro, smo tudi v celičnih kulturah pri mutanti T187I opazili povečano tvorbo PrPRes v primerjavi s proteinom divjega tipa. Z analizo pod mikroskopom na atomsko silo smo ugotovili, da pri pretvorbi T187I nastajajo tanke fibrile, ki jih pri drugih proteinih nismo opazili. Možno je, da I187 v primerjavi z ostalimi mutacijami onemogoča lateralno pakiranje filamentov in tako povzroča bolj učinkovito pretvorbo. Celične linije z za okužbo bolj dovzetnimi mutantami lahko služijo za razvoj bolj občutljivih prionskih celičnih testov.
COBISS.SI-ID: 4764442
Opisali smo novo metodo za sintezo biarzinskih spojin, za katere je značilno, da se specifično vežejo na tetracisteinsko peptidno oznako. Slednjo smo vnesli v različna področja mišjega prionskega proteina in razvili kvantitativno metodo za spremljanje pretvorbe PrP, ki ne uporablja proteaz, ampak temelji na različni prepoznavi monomerne in patološke oblike z biarzinskim reagentom. Pokazali smo tudi, da lahko s temi reagenti detektiramo s tetracisteinsko oznako označen PrP v celičnih kulturah, kar še razširja možnost uporabe te metode za detekcijo in študij konformacijskih bolezni.
COBISS.SI-ID: 4377626
Pri prionskih boleznih se celična oblika prionskega proteina (PrPC) konformacijsko pretvori v PrPSc, obliko s povečanim deležem ß-sekundarne strukture. PrPC je sestavljen iz nestrukturiranega N-končnega dela in globularne, C-končne domene, ki vsebuje tri alfa vijačnice (H1, H2, H3) in antiparalelno beta ploskev (B1, B2). Zanka B2-H2, ki ima ključno vlogo pri medvrstni barieri, vsebuje največjo gostoto asparaginskih (N) in glutaminskih (Q) aminokislinskih ostankov v celotnem zaporedju prionskega proteina. S Q/N-obogatene domene so ključne za pretvarjanje prionov iz kvasovk. Raziskali smo vlogo Q/N aminokislinskih ostankov v zanki B2-H2 pri pretvarjanju prionskega proteina. Pripravili smo mutante s povečanim številom zaporednih Q/N v zanki B2-H2. Stabilnost mutant je padala obratno sorazmerno s številom Q/N. Morfologija fibril je bila podobna kot pri fibrilah divjega tipa, faza zakasnitve fibrilizacije pa se je s številom Q/N krajšala. Pokazali smo, da je efekt povečanja Q/N specifičen za zanko B2-H2 in ni posledica večje fleksibilnosti zanke, saj uvedba zaporedja, obogatenega bodisi z glicinskimi in serinskimi bodisi z alaninskimi ostanki namreč kljub zmanjšani stabilnosti podaljša fazo zakasnitve fibrilizacije. Naši rezultati demonstrirajo, da Q/N zaporedje v zanki B2-H2 promovira pretvorbo in morda predstavlja povezavo s Q/N-prioni (kvasnimi prioni).
COBISS.SI-ID: 4766234