Komunikacija je zaznavanje celične gostote in aktivacija različnih prilagoditvenih mehanizmov, ki vključujejo izmenjavo specifičnih signalnih molekul. Znano je, da igra gostota ključno vlogo pri komunikaciji, medtem ko je vpliv drugih faktorjev (npr. slanost, temperatura) manj poznan. Razpravljali smo o kvantitativnih metodah za zaznavanje signalov in mikrobnih odgovorov na okoljski stres pri štirih modelnih sistemih, ki vključujejo dve po Gramu negativni bakteriji Vibrio sp. in C. jejuni, po Gramu pozitivno bakterijo B. subtilis in kvasovko S. cerevisiae.
B.04 Vabljeno predavanje
COBISS.SI-ID: 3812984V diplomskem delu smo pokazali, da temperatura vpliva na produkcijo signalnih molekul. Za detekcijo in karakterizacijo signalnih molekul smo le-te ekstrahirali s pomočjo kislega etil acetata iz izrabljenih gojišč kulture divjega tipa Vibrio sp. Tip AHL signalnih molekul smo določili z uporabo TLC in poročevalskega seva E.coli JM109 (pSB401). Za detekcijo AI-2 smo uporabili poročevalski sev Vibrio harveyi BB170. Ugotovili smo, da naravni izolat Vibrio sp. proizvaja le en tip AHL molekul, 3-oksoheksanoil-L-homoserin lakton (OHHL), in dokazali produkcijo AI-2 signalnih molekul. Temperatura vpliva na produkcijo tako AHL kot tudi AI-2 molekul pri divjem sevu Vibrio sp.
D.11 Drugo
COBISS.SI-ID: 3946872Metoda spremljanja QS molekul med fermentacijo, ki je bila postavljena v okviru projekta, je bila predstavljena z vabljenim predavanjem na mednarodnem srečanju strokovnjakov s področja proizvodnje arom kvasovk (2nd European Yeast Flavour Workshop Cost Action FA0907 BIOFLAVOUR). Doprinos metodologije je predvsem v miniaturizaciji, učinkovitosti in hitrosti detekcije aromatskih alkoholov kvasovke, pri čemer metoda ni izgubila občutljivosti in specifičnosti. Proces fermentacije tako lahko poteka v 2 ml bioreaktorjih, detekcija pa je opravljena s HPLC in s fenilno kolono nove generacije. Pri tem ni potrebna izolacija (npr. ekstrakcija) in posebno čiščenje vzorcev. Optimiziran postopek tako močno skrajša, poenostavi in nenazadnje izredno poceni postopek analize (za približno 100 - 1000 krat v primerjavi z obstoječimi metodami).
B.04 Vabljeno predavanje
COBISS.SI-ID: 3920248Čeprav je mehanizem zaznavanja celične gostote (kvoruma) pri Bacillus subtilis dobro poznan, vpliv fizikalno-kemijskih dejavnikov na zaznavanje kvoruma še ni v celoti pojasnjen. V diplomskem delu smo preiskovali vpliv temperature (24, 37 in 51 °C) na koncentracijo signalnega peptida ComX ter na transkripcijo njegovega gena comX in gena comQ, ki kodira izoprenil transferazo odgovorno za nastanek zrelega ComX ter na izražanje gena srfA. Rezultati HPLC analize so pokazali, da koncentracija ComX v gojišču narašča s temperaturo gojenja. V nasprotju s tem smo s kvantitativnim PCR ugotovili, da so bile relativne količine kopij mRNA genov comX, comQ in srfA najnižje pri najvišji temperaturi. In sicer je bilo comX in comQ mRNA štiri krat več pri 24 °C kot pri 51 °C. Izražanje vseh treh preučevanih genov v odvisnosti od temperature ni sovpadalo s hitrostjo rasti, s končno gostoto celic v preučevanih kulturah in s količino ComX v izrabljenem gojišču. Zato lahko zaključimo, da negativni vpliv T na izražanje srfA ni povezan s signalnim peptidom ComX, temveč pri tem verjetno igra ključno vlogo druga regulatorna pot.
D.11 Drugo
COBISS.SI-ID: 4114296Medsebojen vpliv med kvasovkami ter njihov učinek na aromatske snovi, ki določajo aromo vina, ni poznan. Prav tako so v povojih raziskave na področju komunikacije med kvasovkami. Kvasovka Saccharomyces cerevisiae proizvaja komunikacijski molekuli feniletanol in triptofol, vendar ju izloča v mikromolarnih koncentracijah, zaradi česar je nujna uporaba občutljive analitske metode z nizko mejo določljivosti. V nalogi smo razvili enostavno, hitro in za večino laboratorijev dostopno metodo za detekcijo feniletanola, triptofola in tirozola. Temelji na uporabi tekočinske kromatografije visoke ločljivosti v kombinaciji z visoko specifično fenilno kolono in fluorescenčnim detektorjem. Ker smo predpostavljali, da komunikacijske molekule proizvajajo le žive celice, smo uvedli avtomatsko računalniško štetje živih kvasnih celic s prostodostopnim programom ImageJ. S pomočjo podatka o živih celicah in o koncentraciji proizvedenih aromatskih alkoholov smo uvedli nov parameter – specifično hitrost proizvodnje aromatskih alkoholov. Primernost omenjenega parametra smo preverili tudi na nivoju transkripcije in pokazali, da obstaja sinhronizacija z izražanjem ARO genov, odgovornih za sintezo aromatskih alkoholov. Ugotovili smo, da proizvodnja feniletanola, triptofola in tirozola korelira s celično gostoto in doseže največjo vrednost ob koncu eksponentne faze. Izmed okoljskih dejavnikov, ki so jim kvasovke izpostavljene tekom fermentacije smo preučevali vpliv etanola, dušika, žveplovega dioksida in vpliv prisotnosti kisika ter ugotovili, da dodatek etanola najbolj očitno vpliva na proizvodnjo feniletanola, triptofola in tirozola, saj se z večanjem deleža etanola zmanjšuje specifična hitrost proizvodnje aromatskih alkoholov. Dosedanje objave ne navajajo vpliva feniletanola in triptofola na dinamiko fermentacije in aromo vina. Po dodatku 1000 μM koncentracije feniletanola in triptofola na začetku eno- in večvrstne fermentacije s kvasovkama S. cerevisiae in C. zemplinina smo ugotovili, da dodatek aromatskih alkoholov ne vpliva na živost celic in v večji meri tudi ne na dinamiko fermentacije, ima pa pomemben vpliv na aromatski profil končnega produkta.
D.11 Drugo
COBISS.SI-ID: 4201080