Ruminococcus flavefaciens sodi med najpomembnejše celulolitične bakterijske vrste v vampu prežvekovalcev in debelem črevesu monogastričnih rastlinojedih sesalcev. Njena izjemna učinkovitost pri anaerobni razgradnji (hemi)celuloznih substratov je povezana s sintezo zunajceličnih multiencimskih kompleksov, celulosomov. Izsledki dosedanjih študij, ki temeljijo na proučevanju sevov FD-1 in N17, kažejo, da je zgradba celulosomskih kompleksov bakterij R. flevefaciens kompleksnejša od večine doslej znanih mikrobnih celulolitičnih sistemov. Predstava o celulolitičnem sistemu te vrste temelji predvsem na informacijah o genomskem potencialu za sintezo celulosomskih (strukturnih in katalitskih) proteinov sevov FD-1 in 17, manjkajo pa informacije o tem, kakšna so razmerja med njihovimi produkti (predvsem encimov), ki bi pomagale pri razumevanju njihove vloge v naravnih sistemih ter optimizaciji industrijskih procesov razgradnje celuloze. V pričujočem delu smo na genomski in proteomski ravni preučevali celulolitični sistem mutant R. flavefaciens 007 (007C in 007S), ki se razlikujeta po sposobnosti razgradnje bombaža (enako dobro pa rasteta na celobiozi, ksilanu in mikrokristalinični celulozi). Analiza osnutka genoma je pokazala, da imata seva enako ureditev gruče genov sca, kot so jo doslej potrdili pri še štirih drugih sevih te vrste: 17, FD-1, C94 in JM1. Gručo v naslednjem zaporedju sestavljajo geni scaC-scaA-scaB-cttA-scaE, njihovi produkti pa so po aminokislinskih zaporedjih skoraj identični skafoldinom seva 17 (podobnost je v vseh primerih večja od 99%). Ker se v slednjih zrcali tudi modularna zgradba proteinov, od katere je odvisno sestavljanje celulosomov, smo na osnovi teh podatkov predvideli, da so celulosomi najverjetneje sestavljeni iz sidrnega skafoldina ScaE, ki veže po eno molekulo ScaB. Ta veže 7 molekul ScaA, ki imajo po tri kohezine, na katere se pripenjajo katalitske podenote (neposredno ali preko ScaC). Nabor genov za celulaze, ki smo jih identificirali v osnutku genoma seva 007C obsega po en zapis za encima s katalitskima domenama GH48 in GH44, ter širok spekter domnevnih endoglukanaz iz družin GH9 (14 zapisov) in GH5 (8 zapisov). Pri večini teh encimov smo identificirali dokerinske domene (Dok-1), kar kaže na to, da so vezani v celulosome. Module za vezavo na celulozo (CBM) smo identificirali le v kombinaciji s katalitskimi domenami GH9. Analiza zunajceličnih proteinskih frakcij (z 2D-GE, LC-ESI-MS/MS in encimogrami) je pokazala, da v celulosomih kultur, ki rastejo na celulozi prevladujejo trije encimi: domnevna endoglukanaza iz družine GH9, domnevna eksoglukanaza z družine GH48 in domnevna ksilanaza/mananaza z družine GH26. Poleg prevladujočih encimov se v mnogo nižjih koncentracijah izraža še raznolik spekter drugih (celulosomskih in necelulosomskih) endoglukanaz. Večje endoglukanaze (ki po Mw večinoma ustrezajo GH9 z lastnimi CBM ali Dok-1) se izražajo konstitutivno iz česar sklepamo, da so najverjetneje pomembne v začetnih fazah razgradnje celuloze (pritrjanju in amorfogenezi). Po drugi strani smo manjše encime (ki po Mw ustrezajo GH5) zaznali šele v supernatantu kultur v stacionarni fazi iz česar sklepamo, da gre za encime, ki cepijo produkte prve stopnje hidrolize (najverjetneje večje celodekstrine). Ugotovili smo, da rast na mikrokristalinični celulozi ni povezana le s (povečanim) izražanjem nekaterih celulaz (GH48 in GH5) in skafoldinov (ScaA, ScaB in CttA), temveč se poveča tudi izražanje nekaterih proteinov, ki vežejo sladkorje in sodelujejo pri njihovem prenosu v celice preko sistema ABC-prenašalcev. Pri sevu 007C smo v povezavi z rastjo na mikrokristalinični celulozi opazili še izrazito (več kot 15-kratno) povečanje relativnih količin dveh drugih proteinov: rubreritrina in pilina tipa IV (Pil3). Teh dveh proteinov pri mutanti, ki ne razgrajuje bombaža (007S) nismo zaznali, kar kaže na to, da bi lahko imela pomembno vlogo pri razgradnji te naravne oblike celuloze z visoko stopnjo kristaliničnosti
D.09 Mentorstvo doktorandom
COBISS.SI-ID: 261692672Probiotični izdelki zajemajo različne vrste funkcionalne hrane, prehranskih dopolnil in zdravil. Med glavnimi izzivi, povezanimi s kontrolo kakovosti probiotičnih izdelkov je ugotavljanje njihove sposobnosti preživetja, pri čemer je nujna specifičnost analiz in spremljanje fenotipske in genotipske stabilnosti komercialnih probiotičnih sevov. Proizvajalci morajo zagotoviti metode za kvantifikacijo vključno s pripravo vzorca, zaradi velik vpliva sestave izdelkov na rezultate kvantifikacije. Le nekaj laboratorijev je trenutno akreditiranih za analizo probiotičnih izdelkov. Glede na nedavne zavrnitve trditev povezanih s probiotik in in prehranskimi produkti s strani EFSA je postalo očitno, da so potrebni močnejši dokazi o mehanizmih delovanja probiotikov, ki so namenjeni za prehrano in prehranska dopolnila. Izzivi funkcionalnih študij probiotikov vključujejo sledenje posameznih probiotičnih sevov v kompleksnih vzorcih, kot so črevesni in fekalni vzorci ter vzorci sluznice. Sekvenciranje mikrobnih genomov naj bi postala rutinska analiza, ki bo omogočala na primer in silico identifikacijo sev specifičnih genov ali kontrolo genetske stabilnosti. Razvoj probiotičnih pripravkov, ki omogočajo dolgotrajno preživetje probiotikov pri sobni temperaturi je prav tako pomembna tema. Zgoraj omenjeni problemi in izzivi bodo predstavljeni z demonstracijo izbranih rezultatov lastnih raziskav na področju probioze in izkušenj nedavno ustanovljenega laboratorija za kontrolo probiotičnih izdelkov.
B.04 Vabljeno predavanje
COBISS.SI-ID: 3054984Zakonitosti prehrane laboratorijskih živali se v osnovah ne razlikujejo od zakonitosti prehrane drugih živalskih vrst in človeka. S pravilno prehrano, v organizmu živali dosežemo ravnotežje v prebavi in presnovi energije ter vseh hranljivih snovi. Laboratorijske živali ali njihove organe uporabljamo kot »merilne instrumente« v bioloških poskusih in z uravnoteženo prehrano dosežemo zanesljivost in točnost opravljenih poskusov. Prehrana poskusne živali je pomembna skozi celo njeno življenje, tudi pred začetkom poskusa saj vpliva na njeno oskrbljenost s hranljivimi snovmi in s tem na ravnotežje v presnovi organizma v času poskusa.
D.10 Pedagoško delo
COBISS.SI-ID: 3175560Namen raziskave je bil preučiti vpliv različnih izomer vitamina E (vitE), ekstrakta lesa pravega kostanja (EX-TAN) in njune kombinacije na oksidacijski stres in vivo ter oksidacijsko stabilnost mesa pri piščancih. Individualno smo vhlevili sedemdeset enaindvajset dni starih piščancev in jih razdelili v sedem skupin po deset živali. Negativna kontrolna skupina (K-Palm) je v krmi dobivala 7,5 % palmove masti, pozitivna kontrolna skupina (K-Lan) in ostale poskusne skupine pa 7,5% lanenega olja. V krmo kontrolnih skupin nismo dodali dodatkov, krmo poskusnih skupin pa smo obogatili z različnimi dodatki in sicer: 85 IU vitE/kg v obliki RRR-α-tokoferola (E-RRR85), 85 IU vitE/kg v obliki all-rac-α-tokoferola (E-DL85), 200 IU vitE/kg v obliki all-rac-α-tokoferola (EDL200), 3 g EX-TAN/kg (TAN), 3 g EX-TAN/kg skupaj z 85 IU vitE/kg v obliki all-rac-α-tokoferola (E+TAN). Za merjenje parametrov oksidacijskega stresa smo na koncu 25-dnevnega poskusnega obdobja živalim odvzeli vzorce krvi, jeter in prsne mišice. Stopnjo oksidacijskega stresa smo ovrednotili z merjenjem poškodb DNA limfocitov, vsebnostjo produktov oksidacije maščob (MDA) v krvni plazmi, jetrih in prsni mišici, z merjenjem skupne antioksidacijske kapacitete (TAS) in antioksidacijske kapacitete v maščobah topnih spojin (ACL) v krvni plazmi ter določevanjem antioksidativnih encimov. Določevali smo vsebnost vitamina E v krvni plazmi, jetrih in prsni mišici. Oksidacijsko stabilnost mesa smo ovrednotili z merjenjem MDA v mesu obdelanem na različne načine, z merjenjem pH vrednosti, izceje, električne prevodnosti in barve mesa, določili pa smo tudi maščobnokislinsko sestavo mesa. Obe obliki in koncentraciji vit E, kot tudi kombinacija, so zmanjšali poškodbe DNA limfocitov in vsebnost MDA v prsni mišici. EX-TAN je zmanjšal samo poškodbe DNA limfocitov. Dodatki niso vplivali na antioksidativne encime in TAS. Vsebnost vitE v plazmi in tkivih se je povečala z dodajanjem vitE. Dodatek vitamina E, ne glede na obliko in koncentracijo, ni bil uspešen pri izboljševanju vseh merjenih parametrov oksidacijskega stresa. Pri izboljšanju oksidacijske stabilnosti mesa je bila učinkovita le večja koncentracija vitE. Kombinacija dodatkov je imela pri nekaterih kazalnikih oksidacijskega stresa (vsebnost α-tokoferola v tkivih, oksidacijska stabilnost mesa) značilno ugodnejši učinek kot posamezen dodatek, kar kaže na sinergistično delovanje med vitaminom E in EX-TAN.
D.09 Mentorstvo doktorandom
COBISS.SI-ID: 3048584