Fuzijska pora je lahko pomemben dejavnik za uravnavanje sproščanja hormonov in živčnih prenašalcov. Domneva se, da je fuzijska pora v začetni fazi ozka in stabilna, pozneje pa se razširi in omogoči popolno zlitje mešička s plazmalemo. Namen raziskave je bil preveriti vpliv proteinov SecI/Munc18 na lastnosti fuzijske pore z lektrofiziološko metodo spremljanja membranske kapacitivnosti v majhni krpici membrane. V izolirane podganje laktotrofe smo vnesli mutante Munc18-1, ki vplivajo na vezavo tega proteina s sintaksinom1 (R39C), proteinom Rab3A (E466K) in proteini Mint (P242S). V primerjavi s celicami, ki so izražale le nativni protein Munc18-1, je Munc18-1 E466K povečal frekvenco fuzijskih dogodkov in podaljšal povprečni odprti čas fuzijske pore. Munc18-1 P242S je podaljšal povprečni odprti čas fuzijske pore. Vse mutante so stabilizirale fuzijsko poro v začetni fazi. Posledica vnosa mutant Munc18-1 je bilo tudi zlivanje večjih mešičkov, ki pa najverjetneje niso bile posledice sestavljene fuzije, kar smo potrdili z mikroskopijo STED. Mikroskopija na atomsko silo je pokazala, da vezava Mun18-1 na t.i. zaprto obliko sintaksina1 prepreči vezavo sintaksina1 na sinaptobrevin2 kar prepreči sidranje mešička. V kolikor je sintaksin1 že vezan na protein SNAP25, Munc18-1 ne prepreči vezave s sinaptobrevinom2. Ena od vlog Munc18-1 je torej zagotavljanje sidranja mešičkov prek vezi sintaksin1-SNAP25-sinaptobrevin2, ki je stabilnejša od vezi sintaksin1-sinaptobrevin2. Munc18-1 pa se veže tudi na kompleks sintaksin1-SNAP25-sinaptobrevin2, kar omogoči uravnavanje fuzijske pore.
COBISS.SI-ID: 28521433
Citosolna koncentracija glukoze zrcali bilanco med procesi vstopa glukoze prek plazmaleme in med procesi porabe glukoze. V adipocitih so dosedanji pogledi predvidevali, da je poraba glukoze v citosolu zelo hitra, kar pomeni, da se vsaka molekula, ki vstopi v citosol, zelo hitro fosforilira. Zato se predvideva, da je citosolna koncentracija glukoze zanemarljivo nizka, a še nikoli izmerjena. V pričujoči študiji smo merili dinamiko citosolne glukoze v fibroblastih 3T3-L1 in adipocitih tako, da smo izražali fluorescenčni proteinski nanosenzor (FRET) za določanje koncentracije glukoze FLIPglu-600mu. Merili smo spremembe citosolne koncentracije glukoze tako, da smo spreminjali koncentracijo zunajcelične glukoze in s tem spreminjali koncentracijski gradient za glukozo prek plazemske membrane. Spremembe v citosolni koncentraciji glukoze so bile izmerjene le v 56% 3T3-L1 fibroblastov in 14% v 3T3-L1 adipocitih. V adipocitih je bila mirovna koncentracija glukoze nižja od tiste izmerjene v fibroblastih. Permeabilizacija membrane je povečala citosolono koncentracijo glukoze v adipocitih in inhibitor glikolize iodoacetat ni preprečil porasta citosolne koncentracije glukoze, kar kaže na relativno nizko membransko permeabilnost za glukozo v mirovanju. Študirali smo tudi učinek inzulina in adrenalina. Prvi je povečal koncentracijo citosolne glukoze za 3.6 krat v adipocitih, a ne v fibroblastih. Adrenalin pa je povečal koncentracijo glukoze v fibroblastih a ne v adipocitih. Pač pa je v adipocitih po stimulaciji z inzulinom potekalo pospešeno odstranjevanje glukoze po dodatku adrenalina v primerjavi s kontrolo (p ( 0.001). Ti rezultati kažejo, da se med diferenciacijo v adipocitih razvijejo učinkoviti mehanizmi za vzdrževanje nizke koncentracije citosolne glukoze, ki predvsem temeljijo na nizki permeabilnosti membrane z aglukozo.
COBISS.SI-ID: 28263129