Že nekaj desetletij poznamo peptide iz strupov polžev stožcev, t.i. konopeptide, ki izražajo celo paleto farmakoloških aktivnosti. Malo pozornosti pa je bilo namenjene proteinom z večjo molekulsko maso (HMM) iz strupov mehkužcev. Da bi bolje osvetlili te proteine, smo se v tej študiji posvetili poglobljeni karakterizaciji teh molekul v strupu piscivornega polža Conus consors, in sicer v strupu iz strupne žleze (nezrel strup) in tistemu, ki ga polž injicira v žrtev (zrel strup). HMM smo ločili s pomočjo dvodimenzionalne elektroforeze (2D-PAGE) in posamezne komponente analizirali z masno spektroskopijo (MS). MS rezultate smo interpretirali z analizo po sekvenčni bazi UniProt, C. consors EST knjižnicah strupnega izvodila in žleze slinavke ter genomskih sekvenc. V lumnu izvodila strupa smo identificirali številne proteinske družine, jim pripisali biološko funkcijo in predlagali njihovo vlogo v procesu tvorbe in zorenja strupa. Zanimivo je, da smo odkrili tudi proteine, ki ne spadajo v nobeno od že opisanih družin, tako da je njihova funkcija za enkrat še neznana. Le dve skupini HMM sta prešli selekcijski proces in se znašli tudi v injiciranem strupu. To so ehotoksini in hialuronidaze. To nakazuje tudi njun prispevek v procesu zastrupitve. Naša analiza pomeni velik korak naprej pri opisu nabora proteinov, ki jih uporablja polž stožec pri sintezi strupa, njegovem zorenju in delovanju.
COBISS.SI-ID: 26042407
Presinaptično nevrotoksične fosfolipaze A2 (PLA2) inhibirajo proces recikliranja sinaptičnih mešičkov z endocitozo. V članku razkrivamo način delovanja presinaptično nevrotoksične PLA2 amoditoksina A (AtxA) na od klatrina-odvisno endocitozo v kvasni celici. Ugotovili smo, da AtxA povzroča spremembe v dinamiki tvorbe mešička in njegovi cepitvi od plazemske membrane. Oba učinka sta odvisna od fosfolipazne aktivnosti AtxA. Naši rezultati kažejo, da AtxA ovira aktivnost amfifizina, proteina, ki pomembno sodeluje v procesu endocitoze. Predlagali smo, da AtxA inhibira endocitozo v procesu, ki vključuje tako specifično interakcijo med proteini kot encimsko aktivnost AtxA. Pričakujemo, da predlagani mehanizem delovanja AtxA v kvasni celici velja tudi v sesalski celici. Poznavanje mehanizma delovanja nevrotoksičnih PLA2 na živčne celice utegne razkriti nove možnosti za regulacijo procesa endocitoze.
COBISS.SI-ID: 5026074
APS12-2 je sintetični analog polimernih alkilpiridinijev soli (poly-APS) in je nekompetitivni inhibitor acetilholinesteraze. Ugotovili smo, da APS12-2 blokira živčno posredovano mišično kontrakcijo pri IC(50)= 0.74 μM. Snov je tudi blokirala od acetilholina-odvisen tok skozi Torpedo (α1(2)β1γδ) mišični tip nikotinskih acetilholinskih receptorjev (nAChR), izraženih v oocitah Xenopusa (IC(50)=0.0005 μM). Pokazalo se je tudi, da ima snov večjo afiniteto za Torpedo (α1(2)β1γδ) nAChR kot za mišji (α1(2)β1γε) nAChR. S tem smo prvič pokazali, da APS12-2 zavre živčno-mišični prenos, ne da bi depolariziral transmembranski potencial, vendar z učinkom na postsinaptične nAChR v skeletnem živčno-mišičnem stiku.
COBISS.SI-ID: 3587706
Listeriolizin O (LLO) je pomemben virulenčni dejavnik, ki omogoča znotrajcelični patogeni bakteriji Listeria monocytogenes prehod iz fagolizosoma v citosol. Kljub mnogim raziskavam LLO še vedno ni znan mehanizem tega »pobega«, ki je ključen za patogenezo. Pokazali smo, da pH je nizek pH (v fagolizosomu)pomemben za vzdrževanje nativne zgradne toksina in da spremembe pH (v kislem) niso odločilne za njegovo permeabilizacijsko aktivnost. Nasprotno pa je nevtralna in bazične vrednosti pH povzročile hitro denaturacijo toksina in nastanek agregatov, podobnih amiloidnim. Domnevamo, da prehod LLO v citosol tako povzroči njegovo agregacijo in da je to najpomembnejši razlog za njegovo inaktivacijo v celičnem citosolu.
COBISS.SI-ID: 4881690
Preučevali smo vlogo encimske aktivnosti sekretornih fosfolipaz A2 (sPLA2), vključno s posledičnim sproščanjem arahidonske kisline (AA), pri proženju apoptoze v celicah motoričnih nevronov z amoditoksinom A (AtxA) in homolognimi rekombinantnimi sPLA2 z različnimi encimskimi lastnostmi. Poleg zasledovanja delovanja AtxA smo tako analizirali tudi vplive mutante AtxA (V31W) z zelo visoko encimsko aktivnostjo, encimsko neaktivne S49-sPLA2 (amoditin L, AtnL), njegove mutante (LW) s ponovno vzpostavljeno encimsko aktivnostjo in nestrupene, encimsko aktivne sPLA2 (AtnI2). Dodajanje AA, AtxA, AtxA-V31W in AtnL-LW, vendar ne AtnL in AtnI2, k celicam motoričnih nevronov je privedlo do aktivacije kaspaze-3, fragmentacije DNA in porušenja mitohondrijskega membranskega potenciala. Posledično je prišlo do hitrega in izrazitega zmanjšanja viabilnosti celic motoričnih nevronov, česar nismo zasledili pri (kontrolnih) mišjih mioblastih in človeških embrionalnih ledvičnih celicah. AtxA, AtxA-V31W in AtnL-LW, ne pa tudi AtnL in AtnI2, so specifično sprostile večje količine AA iz živčnih celic, pri čemer je bila ta sposobnost sproščanja jasno povezana s sposobnostjo povzročitve apoptotskih sprememb in zmanjšanja viabilnosti celic. Encimska aktivnost AtxA in podobnih sPLA2 je torej potreben, vendar ne zadosten pogoj, za indukcijo apoptoze celic motoričnih nevronov. Pridobljeni rezultati kažejo, da so specifična vezava Atx na površini celic motoričnih nevronov ter posledična internalizacija in sproženje apoptoze v odvisnosti od encimske aktivnosti toksina, verjetno kot posledica obsežnega zunaj- in znotrajceličnega sproščanja AA, potrebni za povzročitev celične smrti motoričnih nevronov.
COBISS.SI-ID: 26387239