Prenos fosfatne skupine igra osrednjo vlogo v metabolizmu, regulaciji in signalizaciji na molekularni ravni živih organizmov. Ker so fosfatni estri pri fizioloških pogojih kinetično izredno stabilni, je učinkovita kataliza prenosa fosfatne skupine ključnega pomena za omenjene procese. Najboljše razumevanje učinkovite katalize bi omogočil 'posnetek' strukture encimov v trenutku prenosa fosfatne skupine, ko je ta v prehodnem stanju. Slednje je nemogoče, ker so takšni intermediati zaradi svoje kratke življenske dobe 'neulovljivi'. Zaradi tega lahko približno sliko katalitičnega procesa omogočijo le analogi prehodnih stanj, ki se z veliko afiniteto vežejo na aktivno mesto encimov in posnemajo strukturne in energijske razmere encimske katalize. MgF3 je kot izjemno dober analog prehodnega stanja encimov, ki katalizirajo prenos fosfatne skupine, zanimiva sonda za študij strukture in lastnosti aktivnih mest teh encimov. Za razliko od ostalih kovinskih fluoridov se namreč MgF3 ne tvori v raztopini, ker ima premajhno tvorbeno konstanto, in se lahko posledično stabilizira le v aktivnih mestih teh encimov. V tem delu smo na podlagi tega preučevali kinetiko beta-fosfoglukomutaze in analizirali in okarakterizirali inhibicijo tega encima z magnezijevim fluoridom.
COBISS.SI-ID: 26007001
17β-hidroksisteroid-dehidrogenaza iz nitaste glive Cochliobolus lunatus (17β-HSDcl)) je trenutno edini opisan encim med glivnimi hidroksisteroid-dehidrogenazami. Natančne strukturne analize kristalnih struktur apo in holo oblike encima, s kumestrolom inhibiranega ternarnega kompleksa in Y167F mutiranega encima so razkrile manjše konformacijske spremembe v vezavni zanki za substrat, ki bi lahko vplivale na encimsko aktivnost 17β-HSDcl. V vseh kristalnih oblikah ima 17β-HSDcl tetramerno zgradbo z 222 simetrijo. Povezave med monomernimi enotami preko Q osi so močnejše kot povezave preko P osi. NADPH se veže v aktivno mesto 17β-HSDcl v iztegnjeni konformaciji. Kumestrol, nesteroidni rastlinski derivat z estrogensko aktivnostjo, zavira delovanje 17β-HSDcl (2,8 µM IC50; 100 µM [4-estren-3,17-dion]) z vezavo v domnevno vezavno mesto steroida. Njegova vezava je poleg številnih vodikovih vezi dodatno stabilizirana s π-π interakcijami s Tyr212. Hitre kinetične analize so jasno pokazale, da je disociacija koencima najpočasnejša stopnja reakcije. To je poleg slabe topnosti steroida razlog, da se ternarni kompleks encim-koencim-steroid ne more kopičiti.
COBISS.SI-ID: 28926169
Razvili smo učinkovito metodo za identifikacijo biotehnološko zanimivih genov iz ekstremotolerantnih gliv. Metodo smo preizkusili s pripravo cDNA knjižnice izražene v S.cerevisiae, pri čemer je kot donor genov služila halotolerantna kvasovka Rhodotorula mucilaginosa.
COBISS.SI-ID: 2514255
Človeške aldo-keto reduktaze 1C1-1C4 (AKR1C1-AKR1C4) delujejo in vivo kot 3-keto-, 17-keto- in 20-ketosteroid reduktaze in uravnavajo aktivnost androgenov, estrogenov in progesterona in s tem zasedenost in trans-aktivacijo receptorjev za androgene, estrogene in progesteron. Spremembe v izražanju genov AKR1C in delovanju encimov AKR1C so povezane s patofiziološkimi spremembami, zato encimi AKR1C predstavljajo pomembne tarče za razvoj novih zdravilnih učinkovin. V okviru te študije smo v knjižnici fragmentov izvedli virtualno rešetanje visoke zmogljivosti in aktivnost izbranih spojin preverili z biokemijskimi metodami. Našli smo 24 strukturno različnih spojin, ki so imele nizke mikroM Ki vrednosti za AKR1C1 in AKR1C3 ali oba encima. Te spojine so vključevale salicilate in N-fenilantranilne kisline, pa tudi povsem nove spojine. Najboljša selektivna inhibitorja encima AKR1C3 sta imela Ki vrednosti 0,1 mikroM in 2,7 mikroM. Spojine, ki smo jih identificifrali v tej študiji predstavljajo odlično osnovo za nadaljnjo optimizacijo spojin vodnic.
COBISS.SI-ID: 30078937
Pri zdravljenju raka ključen problem v klinični praksi predstavljata pojav neželenih učinkov oziroma neodzivnost tumorja na zdravljenje. Znano je, da na odgovor na zdravljenje vpliva genetska variabilnost encimov, ki so udeleženi pri presnovi zdravil, so tarče njihovega delovanja ali popravljajo poškodbe DNA, nastale kot posledica genotoksičnosti zdravila. Namen naše raziskave je bil določiti vpliv polimorfizmov v poti delovanja spojin platine na izid zdravljenja pri bolnikih z malignim mezoteliomom (MM). Ugotovili smo, da polimorfizmi genov GST niso vplivali na izid zdravljenja pri bolnikih z MM. V skupini bolnikov, ki so bili zdravljeni s spojinami platine je genotip ERCC1 8092C/C vplival na preživetje brez ponovitve bolezni. Genotipa XPD 312Asp/Asp in ERCC1 8092C/C sta bila povezana z večjim tveganjem za pojav neželenih učinkov in daljšim preživetjem brez ponovitve bolezni. Naši rezultati kažejo na to, da polimorfizmi mehanizma popravljanja napak DNA vplivajo na učinkovitost in toksičnost spojin platine pri bolnikih z MM. Če bodo nadaljne farmakogenetske študije potrdile njihovo vlogo označevalcev izida zdravljenja, bi analiza teh polimorfizmov lahko pripomogla k individualizaciji zdravljenja malignega mezotelioma.
COBISS.SI-ID: 28755417