V starejših objavah so pokazali, da lahko siramezin sproži smrt rakavih celic in ima zato velik potencial pri zdravljenju, vendar njegov mehanizem delovanja v celici do sedaj še ni bil pojasnjen. V naši študiji smo pokazali, da je smrt celic HaCaT, sproženo s siramezinom (≥ 20 µM), spremljala značilna apoptotska morfologija, vključno z aktivacijo kaspaz, porušenjem mitohondrijskega membranskega potenciala (MMP) ter iztokom citokroma c v citosol. Za razliko od celic HaCaT pa pri celicah U-87 MG apoptotskih značilnosti nismo zaznali, pokazali pa smo, da pride do porušenja MMP. Pri vseh testiranih koncentracijah siramezina (5 – 40 µM) je prišlo do dviga pH lizosomov brez permeabilizacije membrane lizosomov (LMP) in iztoka lizosomskih hidrolaz v citosol. Lipofilni antioksidant α-tokoferol je za razliko od hidrofilnega antioksidanta N-acetilcisteina učinkovito preprečil celično smrt in porušenje MMP, ni pa imel vpliva na pH lizosomov. Nižje koncentracije siramezina od 15 µM so smrt celic sprožile kasneje, po dveh dneh ali več, kar je verjetno posledica metabolnega in energetskega neravnovesja zaradi napak v endocitotski poti, znotrajceličnem razmeščanju veziklov in ne posledica določenega molekularnega dogodka. V študiji smo pokazali, da ima siramezin več različnih tarč v celici in da verjetno ne deluje le preko sigma-2 receptorjev.
COBISS.SI-ID: 27111975
V preglednem članku smo povzeli pomen in vlogo endocitotske poti v celici. Endocitotska pot je pomembna za vnos snovi iz celičnega mikrookolja ter razgradnjo snovi s pomočjo različnih hidrolaz. Hidrolaze, še posebej cisteinske proteaze pa lahko sprožijo tudi apoptozo, v kolikor pride do njihovega iztoka v citosol. Poznamo tudi precej dolg seznam spojin za katere so poročali, da povzročijo permeabilizacijo lizosomske membrane in s tem sprožijo notranjo pot apoptoze. Take spojine imajo velik terapevtski potencial pri zdravljenju raka. Poleg endocitotske poti pa material namenjen za razgradnjo pride tudi preko avtofagije. Z razgradnjo poškodovanih organelov in drugih molekul celica reciklira material za sintezo novih molekul in tako avtofagija s sistemom endocitotske poti učinkovito kljubuje različnim apoptotskim dražljajem.
COBISS.SI-ID: 26621479
Lizosomski cisteinski katepsini igrajo eno ključnih vlog pri napredovanju tumorjev in metastaziranju v tarčne organe. Njihova proteolitska aktivnost je tesno regulirana z endogeni inhibitorji. Z namenom preučitve vpliva katepsinskega inhibitorja stefina B (StfB) pri raku mlečne žleze, so bile miši z izbitim genom za stefin B križane s transgenim mišjim modelom raka mlečne žleze PyMT. Pokazali smo, da je odsotnost StfB vplivala na zmanjšano velikost tumorjev mlečne žlezne, medtem ko vpliva na metastaziranje v pljuča ni bilo. Pri miših z izbitim genom za StfB je bilo zmanjšanje velikosti tumorjev povezano s povečanjem števila mrtvih celic znotraj tumorjev. Nadaljnje ex vivo analize PyMT tumorskih celic so pokazale, da so le te bolj občutljive na sproženo celično smrti z uporabo lizosomotropnega agensa LeuLeu-OMe. Prav tako izbitje gena za StfB pri tumorskih celicah vpliva na povečano celično smrt zaradi oksidativnega stresa. Ti rezultati nakazujejo na pomembno in vivo vlogo StfB pri zaščiti tumorskih celic proti oksidativnemu stresu in apoptozi sproženi preko lizosomske poti.
COBISS.SI-ID: 26964263
Vloga posameznih cisteinskih katepsinov kot mediatorjev programirane celične smrti je odvisna od več faktorjev, kot npr. od vrste signala, njegove intenziteta in trajanja ter od vrste celic. Med 11 znanimi cisteinskimi katepsini ima samo katepsin F podaljšano N-terminalno proregijo, ki vsebuje cistatinu-podobno domeno. Ugotovili smo, da se katepsin F divjega tipa nahaja v veziklih v HEK293 celicah, kjer kolokalizira s proteinom LAMP-2, ki je marker za lizosome. V nasprotju s tem pa smo ugotovili, da je bilo več N-terminalno skrajšanih variant proteina prisotnih v netopni obliki, kar kaža na to, da delecija signalnega peptida vodi do agregacije proteina. Agregati so se nahajali v agresomu podobnim inkluzijam, ki so bile imunopozitivne na protein p62 on skolokalizirane z markerjem za avtofagijo LC3B, ne pa z markerjem za lizosome LAMP-2. Kljub manjšemu dvigu DEVD-azne aktivnosti apoptoze nismo zaznali. Ti rezultati kažejo na to, da se agregati N-terminalno skrajšanih oblik katepsina F odstranjujejo s pomočjo avtofagije, ki ima tako zaščitno vlogo v celici.
COBISS.SI-ID: 26842407
Proteina SMOC-1 in SMOC-2 sta zunajcelična kalcij-vezavna proteina, ki ju uvrščamo v družino proteina BM-40. Ugotovili smo, da za razliko od ostalih članov družine proteina SMOC na C-koncu vsebujeta motiv za vezavo glikozaminoglikanov. Z gelsko izključitveno kromatografijo smo dokazali, da tako celoten protein SMOC kot tudi zunajcelična kalcij vezavna (EC) domena specifično vežeta heparin in heparan sulfat ter določili ravnotežne disociacijske konstante interakcij, katerih vrednosti se nahajajo v nizkem mikromolarnem območju. S testi na celičnih linijah smo dokazali, da domena EC proteina SMOC-1 stimulira pritrjevanje celic HaCaT. Glede na to, da je ob popolni odstranitvi heparin-vezavnega mesta s pritrjevanje celic na domeno EC onemogočeno, smo sklepali, da igra tako funkcionalnost kot tudi dostopnost heparin-vezavnega mesta domene EC pomembno vlogo pri procesu adhezije epitelijskih celic na protein SMOC-1.
COBISS.SI-ID: 36550661