Raziskave na področju proteaz so v zadnjem desetletju doživele velik razmah, kar je povezano predvsem z izjemno hitrim razvojem novih tehnologij, kot npr. kvantitativne proteomike in in vivo imaginga ter intenzivne uporabe in vivo modelov. To je vodilo do identifikacije fizioloških substrates in povzročilo premik v načinu razmišljanja od koncepta proteaz kot encimov odgovornih za razgradnjo proteinov do koncepta proteaz kot ključnih signalnih molekul. Kljub temu smo še vedno na začetku razumevanja signalnih poti, ki jih uravnavajo proteaze. Do sedaj smo namreč identificirali le majhen delež pravih fizioloških substratov za omejeno število proteaz. Prav tako ne razumemo dobro niti fiziološke regulacije proteaz, niti ne poznamo povezav z drugimi signalnimi sistemi. Zato so v zbirnem članku osvetljeni trenutni izzivi na področju raziskav proteaz.
COBISS.SI-ID: 25737767
Lizosom so odkrili pred več kot 50 leti. Od takrat je njegovo hidrolitično delovanje, vključno s proteazami in drugimi hidrolazami, dobro preučeno in opisano. Med najpomembnejše prištevamo tudi cisteinske katepsine, ki so člani družine papainu podobnih cisteinskih proteaz. Njihovo aktivno mesto ima posebne lastnosti in so neenakomerno izraženi v tkivih. V živih organizmih je njihovo delovanje strogo uravnavano na nivoju izražanja, ciljanja, z aktivacijo proencima, zaviranjem s proteinskimi inhibitorji in njihovo razgradnjo. Specifičnosti vezavnih mest substrata, raznolikost majhnih molekulskih zaviralcev in poznavanje kristalne strukture lahko tako izkoristimo za razvoj in uporabo novih orodij. Edinstvene lastnosti reaktivnega mesta smo lahko uporabili za lažje določanje tarč na podlagi ustreznih reaktivnih skupin. Danes se kljub temu, da so v širši uporabi predvsem epoksisukcinili, vedno bolj uveljavljajo nitrili. Prvotno prepričanje, da so cisteinski katepsini zgolj lizosomalne proteinaze, je bilo ovrženo, saj je bilo dokazano, da so prisotni tudi v drugih celičnih organelih. Poleg tega, da so vključeni v procesiranje proteinov, so ključni pri endosomalni predstavitvi antigenov. Z večanjem števila znanih ne-endosomskih vlog cisteinskih katepsinov se širi tudi razumevanje povezave med katepsini in boleznimi, kot sta med drugim rak in revmatoidni artritis. Poleg tega pa so cisteinski katepsini vključeni v številne biološke procese kot regulatorne in signalne molekule. Sedanji izziv je torej določiti njihove endogene substrate, da bi pridobili celovit vpogled v mehanizme razgradnje substrata in obdelave. V tem pregledu so predstavljeni najpomembnejši napredki, ki smo jih naredili v zadnjem desetletju.
COBISS.SI-ID: 25347623
V tem delu smo identificirali zunajcelični šaperon klasterin kot specifičen vezavni protein za katepsin K, ki je ključna peptidaza v procesih preoblikovanja kosti, sodeluje pa tudi pri drugih zunajceličnih proteolitičnih procesih. Pokazali smo, da klasterin ne vpliva neposredno na aktivnost katepsina K, vpliva pa na njegovo stabilnost tako v razredčenih raztopinah kakor tudi v prisotnosti visokih koncentracij drugih proteinov. Klasterin je prvi znan vezavni partner katepsina K, ki se ne veže v aktivno mesto, obenem pa je katepsin K prvi znan encim, katerega aktivnost lahko klasterin stabilizira. Stabilizacija aktivnosti katepsina K je verjetno pomemben faktor v njegovem zunajceličnem delovanju, saj je ta peptidaza nestabilna pri nevtralnem pH-ju zunajceličnega okolja. Ugotovili smo tudi, da ob uporabi nekaterih sintetičnih substratov klasterin deluje na katepsin K tako, da prepreči počasno inhibicijo s substratom, ki se pojavi pri visokih koncentracijah slednjega. Ta efekt t.i. liberatorja verjetno nima fiziološkega pomena, kaže pa, da vezava klasterina vpliva na fleksibilnost katepsina K. Obenem smo z merjenjem tega efekta enostavno kvantificirali interakcijo med klasterinom in katepsinom K.
COBISS.SI-ID: 25723175
Sproščanje ščitničnega hormona tiroksina iz tiroglobulina nadzira kompleksen regulativni sistem. Osredotočili smo se na zunajcelično delovanje dveh lizosomskih encimov, katepsina C in PGCP, na tiroglobulin in njuno sposobnost sproščanja tiroksina. Za katepsin C je znano, da lahko odcepi dipeptide iz N-terminalnega dela substratov, PGCP pa dipeptide hidrolizira do aminokislin. In vitro poskusi so pokazali, da katepsin C odstrani do največ 12 aminokislin iz N-terminalnega dela prašičjega tiroglobulina, vključno s tiroksinom na položaju 5. Novonastali N-terminalni del tiroglobulina, arginil-prolil-, katepsin C ne cepi več. Celično linijo tirocitov FRTL-5 smo uporabili za določevanje lokalizacije ter sekrecije katepsina C in PGCP. Ugotovili smo, da je izločanje aktivnega katepsin C iz FRTL-5 celic je stimulirano s TSH, insulinom in/ali somatostatinom. Sproščeni encimi sproščajo tiroksin iz tiroglobulina, dodanega v medij. Sproščanje hormona lahko znižajo sintetični inhibitorji cisteinskih in metaloproteinaz. Poleg tega smo pokazali, da je TSH, insulin, in/ali somatostatin sprožijo povišano izražanje N-acetilglucosaminiltransferaze 1, encima, ki je odgovoren za začetek sinteze hibridne in kompleksne N-glikozilacije proteinov.
COBISS.SI-ID: 25646375
Lizosomi so ključni celični vezikli celične razgradnje. Lizosomski katepsini pomagajo ohranjati homeostazo celičnega metabolizma tako, da sodelujejo pri razgradnji heterofagnega in avtofagnega materiala. Po ciljani destabilizaciji lizosomske membrane se katepsini sprostijo v citosol in sprožijo lizosomsko pot apoptoze s cepitvijo proteina Bid in razgradnjo anti-apoptotskih homologov Bcl-2. Tudi če apoptozo sprožimo z drugimi dražljaji, lahko kasneje pride do poškodbe lizosomske membrane in katepsini pomnožijo apoptotski signal. Nasprotno pa funkcionalna celovitost lizosomskih veziklov med apoptozo omogoča učinkovito avtofagijo, ki priskrbi celici dodatne vire energije in sproti odstranjuje poškodovane mitohondrije, ki tvorijo ROS, kar apoptozo zavira. Oviranje avtofagije prek preprečevanja funkcije lizosomov se preizkuša kot adjuvantni terapevtski pristop, ki bi celice senzibiliziral za snovi, ki sprožajo apoptozo. Destabilizacija lizosomskih membran z lizosomotropnimi detergenti se zdi obetavna strategija, saj ne le da onemogoči avtofagijo, ampak tudi pospeši apoptozo prek lizosomske poti. Biti pa moramo pozorni, saj so motnje avtofagije in razgradnje v lizosomih pri starajočih nevronih povezane s povečanjem oksidativnega stresa, ki je osnova degenerativnih sprememb. Sklepamo, da imajo lizosomi in lizosomski katepsini dvojno vlogo pri celični smrti.
COBISS.SI-ID: 25347879