Separacija in izolacija glavnih sirotkinih proteinov je že ekstenzivno pokrita v literaturi, toda v nobeni študiji niso bile uporabljene monolitne kolone. V naših raziskavah prvič predstavljamo uporabo kratkih monolitnih kolon (CIM – convective interaction media) za separacijo vseh glavnih sirotkinih proteinov in izolacijo β-lactoglobulin variante A in B (β-LgA in β-LgB) iz komercialnega produkta – whey isolate (WI). Čeprav je bil glavni cilj študije poiskati primerno monolitno kolono in izbrati prave pogoje za čiščenje in izolacijo β-LgA in β-LgB, smo tekom študije razvili tudi tri dodatne analizne LC metode, pri čemer ima vsaka izmed njih potencialno aplikacijsko tarčo. Na monolitni dietilaminoetil CIM analitski koloni (CIMac DEAE) smo dosegli separacijo glavnih sirotkinih proteinov s postopnim zniževanjem pH vrednosti mobilne faze. Težko dosegljiv linearen eksterni pH gradient je bil linearen v pH območju 5,5-3 in razvita ionsko izmenjevalna tekočinsko kromatografska metoda visoke ločljivosti je bila primerna za sklopitev z masno spektrometrijo (MS). Zelo hitro separacijo sirotkinih proteinov z UV detekcijo smo dosegli v štirih minutah, z uporabo prototipa CIMac reverzno-fazne stiren-divinilbenzen (RP-SDVB) monolitne kolone. Prototip se je izkazal bolj učinkovit v primerjavi s polnjeno POROS perfusion kolono. Razvita RP-HPLC-MS metoda je hitra in lahko zaradi uporabe MS detektorja, nudi nižje meje zaznave in določljivosti. Na koncu smo razvili še »scale-up« metodo z uporabo 8 mL analoga prototipa CIMac RP-SDVB kolone za izolacijo nativnega in kemijsko nemodificiranega β-LgA oz. β-LgB iz WI, s stopnjo čistote višjo od 90% oz. 81% ter tako dosegli naš glavni cilj študije. Ta dva proteina sta bila nato naprej uporabljena v študijah interakcij med proteinom in ligandom. Razvite metode se odlikujejo v hitrosti analize, občutljivosti, ločljivosti in enostavnosti. Torej, prvič smo pokazali, da so kratke monolitne kolone uporabne za separacijo in izolacijo glavnih sirotkinih proteinov in da ima njihova uporaba nekaj očitnih prednosti.
COBISS.SI-ID: 4909850
Glavna težava pri denzitometričnem določanju karotenoidov je njihova hitra razgradnja na sorbentu med oziroma takoj po kromatografiji (pred denzitometrijo). V študiji smo pokazali, da 15 ng standardov luteina, likopena in β-karotena, ki smo jih nanesli na C18 RP HPTLC plošče predhodno razvite z diklorometan-metanol 1:1 (v/v), ostane stabilnih 1h po razvitju plošč v metanol-aceton 1:1 (v/v) z dodatkom 0,1 % 2-terc-butilhidrokinona (TBHQ), kar je znatno izboljšanje njihove stabilnosti. Ta rešitev je bila predpogoj za razvoj in validacija nove HPTLC metode za kvantitativno določanje luteina, z uporabo denzitometrije pri 450 nm. Ponovljivost kromatografije, izražena z relativno standardno deviacijo (RSD), pri šestih nanosih 5, 15 in 25 ng standarda luteina je bila 3,41, 1,33 in 1,65 %. V območju od 5 ng do 30 ng je bila umeritvena krivulja polinomska. Doseženi meja zaznave (1,5 ng) in meja določitve (5 ng) sta bili najboljši doslej. Pod temi kromatogrfskimi pogoji smo v prehranskih dopolnilih tudi dobro ločili luteinske estre, likopen, prosti lutein in β-karoten in jih identificirali na podlagi absorpcijskih spektrov posnetih in-situv vidnem spektralnem območju in na podlagi masnih spektrov. Za hitro separacijo luteinskih estrov od prostega luteina v prehranskih dopolnilih, so predlagana nekatera dodatna topila za razvijanje pri uporabi enakega tipa sorbenta kromatografske plošč.
COBISS.SI-ID: 4915226
Šikonin in njegovi esterski derivati spadajo v skupino sekundarnih metabolitov, ki imajo širok spekter učinkov, ki blagodejno vplivajo na zdravje človeka. Kljub temu se šikonin uporablja predvsem v preparatih, ki temeljijo na oljni osnovi, zaradi slabe topnosti pigmenta v vodnih medijih, zato pozitivne lastnosti šikonina niso popolnoma izkoriščene. Nizka vodotopnost ima pogosto za posledico slabo biološko dostopnost in neprimernost šikonina za oralno uporabo, poleg tega pa preprečuje njegovo širšo uporabo v prehrambeni in farmacevtski industriji. Namen študije je bil povečati vodotopnost šikonina z dodatkom β-laktoglobulina in okarakterizirati interakcijo med makromolekulo in ligandom s pomočjo spektrofotometrije, spektrofluorimetrije, tekočinske kromatografije visoke ločljivosti in masne spektrometrije. V prisotnosti β-laktoglobulina se je vodotopnosti šikonina povečala do 181-krat. Ena molekula šikonina se veže na β-laktoglobulin kovalentno preko Cys 121, ostale molekule pigmenta pa se najverjetneje vežejo na protein preko nekovalentnih interakcij.
COBISS.SI-ID: 5114394