Sedanja raziskava predstavlja korak k razumevanju mehanizma zvijanja bioloških makromolekul v svoje funkcionalne naravne konformacije. Z uporabo NMR spektroskopije in drugih metod nam je uspelo detektirati pred-zvita stanja DNA oligonukleotidov, ki izhajajo iz človeškega telomernega zaporedja in so prisotna v raztopini preden se tvorijo G-kvadrupleksi po dodatku kationov. Za preučevana oligonukleotida smo pri določeni pH vrednosti in temperaturi odkrili nepričakovano dobro definirane pred-zvite strukture, sestavljene iz baznih tripletov. Tovrstne strukture so bile do sedaj le stvar raznih hipotez, kot vmesni intermediati na poti zvijanja. Skupna značilnost vseh pred-zvitih struktur (z baznimi pari in z baznimi tripleti, z antiparalelno topologijo zvitja v obliki stola in lasnica) je, da sta prvi in drugi gvaninski-trakt med seboj povezana v antiparalni orientaciji. Ta strukturna značilnost je lahko glavni razlog za različne poti zvijanje DNA oligonukleotidov, ki izhajajo iz človeškega telomernega zaporedja, v njihove končne G-kvadrupleksne strukture. Karakterizacija dolgoživih pred-zvitih struktur je bistvenega pomena ne le za določitev mehanizmov tvorbe G-kvadrupleksov, saj lahko predstavljajo intermediate na ali izven poti zvijanja, temveč jih je mogoče uporabiti tudi pri razvoju novih vrst selektivnih ligandov, ki bodo ciljali njihove značilne strukturne elemente že preden se tvorijo G-kvadrupleksi.
COBISS.SI-ID: 6795290
V sodelovanju s kolegi iz Italije smo preučevali tvorbo i-motivov znotraj dolgih terminalnih ponovitev promotorja HIV-1 genoma. i-motivi so nekanonične strukture nukleinskih kislin, ki so karakterizirane s tvorbo interkaliranih vodikovih vezi med hemi-protoniranimi citozinskimi ostanki. Dokazi o vpletenosti i-motivov pri uravnavanju celičnih procesov v človeških celicah v zadnjih letih nenehno rastejo. i-motivi do sedaj niso bili preučevani v nečloveških genomih. V tem delo smo se ukvarjali s karakterizacijo i-motivov znotraj dolge terminalne ponovitve (LTR) promotorja provirusnega genoma HIV-1. Biofizične in biokemične analize so pokazale, da se v večini tvorijo strukture i-motivov z zanimivo sestavo povezovalnih zank. S pomočjo nuklearne magnetne resonance smo pokazali, da se znotraj dolgih povezovalnih zank v strukturi i-motivov tvorijo Watson-Crick G-C bazni pari, kar verjetno izboljša stabilnost celotne strukture. ''Pull-down'' test v kombinaciji z masno spektroskopijo in proteinsko povezovalno analizo je pokazal, da LTR i–motive prepozna celični protein hnRNP K, ki povzroči njihovo zvitje pri fizioloških pogojih. Poleg tega je utišanje hnRNP K proteina povzročilo povečano aktivnost promotorjev LTR, kar je potrdilo sposobnost proteina, da stabilizira tvorbe i-motivov, kar posledično uravnava transkripcijo HIV-1. Te ugotovitve predstavljajo nov vpogled v kompleksnost virusa HIV-1 in postavljajo temelje za inovativno zasnovo protivirusnih zdravil, ki bi temelja na sposobnosti selektivnega odkrivanja in ciljanja HIV-1 LTR i-motivov.
COBISS.SI-ID: 40309253
Fluorirane molekule RNA, zlasti 2'-F RNA, so našle široko paleto aplikacij v RNA terapevtskih, aptamerih in ribocimih ter kot 19F NMR sonde za strukturne študije RNA. Zaradi nestabilnosti 4'-F ribonukleozidov je bila sinteza 4'-F-modificirane RNA že dolgo izziv. V tej študiji smo razvili strategijo za sintezo fosforamidita 4'-F-uridina (4'-FU) in uporabili smo ga za uspešno pripravo 4'-F RNA. V okviru vijačnice RNA je bil 4'-FU, ki je obstajal v severni konformaciji, razmeroma stabilen in je bil podoben nespremenjenemu uridinu. 19F NMR signal 4'-FU pa je pkazal občutljivost na sekundarno strukturo RNA, z disperzijo kemičnega premika kar 4 ppm (v primerjavi z (1 ppm za 2 'FU), zaradi česar je dragocena sonda za razlikovanje enoverižne RNA in duplekse tipa A, tipa B in neidelano parjene duplekse. Pokazali smo, da se lahko zaradi uporabe encimov za predelavo RNA, ki so obravnavali 4'-FU enako kot nemodificirani uridin, uporabi 4'-FU za spremljanje strukturne dinamike RNA in obdelavo z RNA z encimi. Naši rezultati skupaj kažejo, da 4'-F RNA predstavlja sondo s široko uporabnostjo za razjasnitev strukture in funkcije RNA z 19F NMR spektroskopijo.
COBISS.SI-ID: 6801434