Pri vsem, kar je znanega o encimih, v znanstveni skupnosti še vedno ni soglasja o izvoru njihove katalitske funkcije. Raziskave s tega izjemno pomembnega in fundamentalnega področja so osredotočene okrog dveh hipotez: (1) encimska kataliza izvira iz preorganizirane elektrostatike in (2) encimska kataliza izvira iz neravnotežnih dinamskih učinkov. Študija sodelavcev Teoretičnega odseka prinaša pomembna spoznanja o encimski katalizi, ki govorijo močno v prid prvi hipotezi. Razvili smo preprost, a učinkovit multiskalni model, s katerim smo proučevali vlogo elektrostatike v encimskih reakcijah. Model temelji na kvantno kemijskem opisu reaktivnega dela (aktivnega mesta encima s substratom), medtem ko za okolico uporabimo točkaste naboje, ki ustrezajo posameznim atomom v encimu. Tak opis je računsko razmeroma nezahteven, hkrati pa omogoča poljubne manipulacije z elektrostatsko okolico – med drugim jo lahko v celoti ali selektivno vključimo ali izključimo iz modela – in s tem nudi prvovrsten vpogled v vlogo elektrostatike v encimskih reakcijah. Z opisanim modelom smo obravnavali 100 reprezentativnih struktur izbrane encimske reakcije (katalitični korak oksidacije feniletilamina z encimom monoamino oksidaza A), ki ustrezajo stanju reaktantov, ter 100 struktur, ki ustrezajo prehodnemu stanju. Z vključevanjem in izključevanjem (»ON/OFF«) okoliških nabojev encima smo dokazali, da ima encimska elektrostatika velik katalitičen vpliv na vse parametre reaktivnosti in kinetike – med drugim zniža aktivacijsko pregrado za 14 kcal/mol, poveča količino prenesenega naboja za 40% ter zmanjša energijsko vrzel med reaktivnima orbitalama (HOMO-LUMO) za 20%. Analiza pokaže, da je za katalitično funkcijo encima ključno, da se v prehodnem stanju poveča dipolni moment reaktivnega dela, kakor tudi velikost električnega polja, s katerim encim deluje na aktivno mesto. Navedene ugotovitve se skladajo s hipotezo, da encimska kataliza izvira iz t.i. preorganizirane elektrostatike – struktura encima je evolucijsko optimizirana tako, da prek elektrostatskih interakcij stabilizira prehodno stanje, pri čemer se zniža aktivacijska pregrada, reakcija pa poteka znatno hitreje.
COBISS.SI-ID: 6556442
V raziskavi smo z uporabo kristalne strukture topoII ATPazne domene optimizirali kemijsko serijo 4,6-substituiranih-1,3,5-triazin-2 (1H)-onov kot katalitičnih zaviralcev topo II alfa, ki ni izkazovala citotoksičnih lastnosti. Zgradili smo usmerjeno kemijsko knjižnico možnih derivatov, za nadaljnjo funkcionalizacijo substituentov na položaju 4 1,3,5-triazin-2 (1H)-onskega obroča, ki bi lahko tvorili dodatne interakcije s tarčnim vezavnim mestom za ATP. Po izvedenem virtualnem rešetanju smo sintetizirali 36 izbranih analogov in jih eksperimentalno ovrednotili na inhibicijo humane topo II alfa. Optimizirana serija je pokazala izboljšano inhibicijo encima v primerjavi s prvotno serijo ter ohranila katalitični mehanizem inhibicije. Molekule so izkazovale tudi citotoksičnost na HepG2 in MCF-7 rakavih celičnih linijah in niso povzročile prelomov molekule DNA, kar pomeni, da tudi na celičnem nivoju delujejo preko mehanizma, ki se razlikuje od topo II strupov. Nova serija predstavlja pomemben nov korak v razvoju razreda substituiranih 1,3,5-triazin-2 (1H) -ona kot skeleta za razvoj protirakavih učinkovin.
COBISS.SI-ID: 6615834
V raziskavi smo kot izhodiščno točko načrtovanja uporabili poznane zaviralce bakterijske topoizomeraze tipa II, substituirane 4,5'-bitiazole. S primerjavo ATP vezavnih mest DNA giraze in človeške topo II? smo določili ključne razlike in podobnosti v vezavnih mestih, ki so omogočile virtualno rešetanje usmerjene kemijske knjižnice za identifikacijo zaviralcev, ki bi se bolje vezali na človeško topoizomerazo II?. Spojine tega razreda delujejo kot katalitični ATP kompetitivni zaviralci človeške DNA topoizomeraze II? in se vežejo na izolirano ATPazno domeno. Spojine so bile učinkovite tudi na celičnem nivoju, saj so nekatere izmed njih izkazovale citotoksičnost na HepG2 in MFC-7 celični linijah v enakem obsegu kot uveljavljena protirakava zdravilna učinkovina etopozid. Za izbrano spojino smo ugotovili, da ustavi celični cikel v G1 fazi, vpliva na proliferacijo celic ter dokazali, da ne povzroča dvojnih prelomov DNA, kar je dodatni dokaz, da spojine tega razreda tudi na celičnem nivoju delujejo drugače kot topo II strupi.
COBISS.SI-ID: 18365443
Proučevali smo nivo dopamina v treh predelih dopaminergične sinapse, vključno s presinaptičnim nevronskim citosolom, vezikli za shranjevanje dopamina in sinaptično špranjo. Z upoštevanjem treh transportnih poti (dopaminski transporter (DAT), vezikularni transporter (VT) in eksocitoza) smo preučili štiri simulirane scenarije: homeostazo, uporabo kokaina, metamfetamina in rezerpina. Nedavni poskusi kažejo, da se po dajanju kokaina konstantna hitrosti permeacije DAT za vinsko mušico zmanjša za 55% in to vrednost smo sprejeli za humani DAT. Amfetamin in metamfetamin inhibira DAT in VT, rezerpin pa inhibira pa VT; vendar njihove eksperimentalne konstante zmanjšane permeabilnosti niso na voljo. Časovno odvisne nivoje dopamine smo zapisali z diferencialnimi enačbanmi in jih reševali numerično. Pokazali smo, da se v citosolu koncentracija dopamina v primeru metamfetamina in rezerpina povečuje, vendar je bila pri uporabi kokaina praktično nespremenjena. To kaže, da so amtetamini in druge snovi, ki blokirajo VT, lahko etiološko pomembne pri citosolnem dopaminskem posredovanju nevrodegeneracije pri Parkinsonovi bolezni / parkinsonizmu, medtem ko je uporaba kokaina v tem pogledu varna.
COBISS.SI-ID: 6756378
Nuklearni kvantni efekti, med njimi tuneliranje, imajo pomembno vlogo v mehanizmih encimsko kataliziranih reakcijah, pri čemer kvantna narava nekaterih atomov, zlasti vodikovega, ki sodeluje v rekaciji, omogoča hitrejši potek, pri čemer je kinetična komponenta tuneliranja neodvisna od temeprature. Eksperimentalno merilo nuklearnih kvantnih efektov je H/D kinetični izotopni efekt, ki ga je mogoče razmeroma enostavno izmeriti. Vpliv nuklearnih kvantnih efektov smo s simulacijskimi tehnikami proučevali na primeru encima monoamino oksidaze A in substrata feniletilamina, pri čemer smo uporabili dva različna pristopa. V obeh primerih smo uspeli zelo natančno in pravilno napovedati vrednost kinetičnega izotopnega efekta. Vpliv nuklearnih kvantnih efektov (tuneliranja) na reakcijsko kinetiko je razmeroma majhen, dobro ujemanje z eksperimentalnimi kinetičnimi podatki pa potrjuje, da je predpostavljeni reakcijski mehanizem pravilen, kar pomembno prispeva k razumevanju delovanja encimov MAO.
COBISS.SI-ID: 21912067