Tiroglobulin (TG) je proteinski prekurzor ščitničnih hormonov, ki so ključnega pomena za rast, razvoj in nadzor presnove pri vretenčarjih. Sinteza hormonov iz TG se v ščitnici zgodi z jodiranjem in spajanjem parov tirozinov, zaključi pa se s proteolizo TG. Kljub domnevi, da bližina tirozinov znotraj TG omogoča reakcijo spajanja, hormonogeni tirozini do zdaj niso bili jasno določeni, pomanjkanje tridimenzionalne strukture TG pa je preprečevalo razumevanje mehanizma. Tukaj predstavljamo strukturo človeškega tiroglobulina v celotni dolžini z ločljivostjo približno 3,5 A, določeno s krioelektronsko mikroskopijo. V strukturi smo identificirali vse pare hormonogenih tirozinov in jih preverili z uporabo mestno usmerjene mutageneze in in vitro testov za proizvodnjo hormonov s človeškim TG, izraženim v celicah HEK293T. Naša analiza je pokazala, da so bližina, fleksibilnost in izpostavljenost tirozinom ključne značilnosti hormonogenih mest. Reakcijska mesta smo prenesli iz TG na z inženiringom vzpostavljen par darovalca-akceptorja tirozina v nepovezanem bakterijskem proteinu, ki veže maltozo (MBP), ki je omogočil proizvodnjo hormonov z učinkovitostjo, ki je primerljiva s TG. Naša študija ponuja okvir za nadaljnje razumevanje proizvodnje in regulacije ščitničnih hormonov.
COBISS.SI-ID: 34720985
Ireverzibilni kovalentni inhibitorji lahko izkazujejo koristen farmakokinetični in / ali farmakodinamični profil, vendar pa obstaja tveganje, da ti inhibitorji tvorijo kovalentno vez nespecifično, torej tudi z drugimi podobnimi encimi. Posledično lahko pride do neželenih učinkov, zato se jim še vedno pogosto izogibamo. Inhibitorjem katepsina K smo zato uvedli alkinsko skupino, ki deluje kot latentni elektrofil. Ti inhibitorji so selektivno tvorili kovalentno vez z aktivnim cisteinom katepsina K, kar smo potrdili s kristalno strukturo kompleksa. Hitrost tvorbe kovalentne vezi ni sovpadala z elektrofilnostjo alkinske skupine, kar kaže, da je za reakcijo ključno lokalno okolje v aktivnem mestu katepsina. Inhibitorji so preprečili s katepsinom K posredovano resorpcijo kosti v človeških osteoklastih. Ta raziskava prikazuje potencial alkinskih inhibitorjev kot latentnih elektrofilov pri načrtovanju novih inhibitorjev z izboljšanim varnostnim profilom.
COBISS.SI-ID: 32066599
Avtolizin E (AtlE) iz Staphylococcus aureus je encim, ki cepi celično steno in je potencialna tarča za zdravila. Spada v razred glikozid hidrolaz (GH), encimov, ki imajo ponavadi dva katalitična aminokislinska preostanka in hidrolizirajo substrat preko mehanizma z inverzijo ali retencijo anomernega centra ali redkeje en aminokislinski preostanek in reakcija poteče z udeležbo acetilne skupine substrata. V tem delu naslavljamo katalitični mehanizem AtlE. Z uvajanjem točkovnih mutacij smo identificirali Glu138 kot edini katalitični preostanek. Kvantno- in molekularno mehanske simulacije možnih reakcijskih poti so pokazale, da hidroliza poteka preko mehaniza s pomočjo molekule vode preko oksokarbenijevemu ionu podobnega prehodnega stanja pri katerem se ohrani anomerni center. Ti rezulatati skupaj s podatki o drugih članih družine GH73 podpirajo našo hipotezo o novem katalitičnem mehanizmu pri tej družini, ki se lahko uporabi pri prihodnjem načrtovanju AtlE inhibitorjev.
COBISS.SI-ID: 31330087
Za produktivno vezavo substrata na encim se morata geometriji obeh molekul uskladiti tako, da se prilegata ena drugi po celotni dolžini vezavnega mesta. V iskanju novih tarč za antibiotike za človeški pathogen Staphylococcus aureus, smo preučili dve peptidoglikan N-acetilglukozaminidazi, SagB in AtlA-gl, ki sta sestavljeni iz dveh domen, ki tvorita aktivno mesto v obliki črke V. Z uporabo rentgenske kristalografije, točkovne mutageneze, modeliranja in molekularne dinamike smo pojasnili mehanizem vezave substrata SagB in AtlA-gl. Oba encima sta kristalizirala v odprti obliki, ki omogoča vezavo polisaharidnega substrata. Da lahko poteče reakcija, se morata po vezavi substrata encima zapreti. To se zgodi tako, da se domeni zavrtita in pomakneta ena proti drugi. Razlika med začetno in končno konformacijo je presenetljivo velika. Tako veliki konformacijski premikih so precej redko opisani v dosedaj dostopni literaturi, čeprav je vedno več dokazov, da verjetno niso tako redki, kot smo to mislili v preteklosti. Poleg tega bodo ta nova spoznanja prispevala k razumevanju metabolizma celične stene S. aureus.
COBISS.SI-ID: 33308455
Validacija tridimenzionalnih struktur sodi v jedro metod za določevanje struktur. Lokalni validacijski kriteriji, kot so na primer odstopanje od idealnih dolžin vezi in veznih kotov, odstopanja od dovoljenih območij v Ramachandranovem plotu in bližnji kontakti so standardni del strukturne analize pred njeno depozicijo. Globalno in lokalno zlaganje pa zaenkrat nista bila analizirana. V zadnjih dveh desetletjih so bile tridimenzionalne strukture makromolekul vključno s proteini uspešno opisane z mrežo vozlišč in robov. Amino kislinski preostanki predstavljajo vozlišča, bližnji kontakti med njimi pa robove. Takšne mreže so bile uporabljeni za raziskave osnovnih mrežnih lastnosti pri študijah proteinskega zvijanja in stabilnosti in napovedovanja katalitskih mest. Uporabljajoč analizo kompleksnih mrež, smo vpeljali splošne parametre mreže, da bi z njimi razlikovali med pravilnimi in nepravilnimi strukturami. Analiza je pokazala da imajo pravilne strukture višjo povprečno stopnjo povezav, višjo energijo grafa, in krajšo najkrajšo dolžino poti od njim ustreznih napačnih struktur. Torej, pravilni proteinski modeli so bolj gosto premreženi in s tem omogočajo bolj učinkovit transfer informacij med vozlišči. Spekter grafa je bil uporabljen pri raziskavi molekulskega “biasa” v proteinskih strukturah.
COBISS.SI-ID: 1541072324