Termostabilna serinska proteaza pernizin izvira iz hipertermofilne arheje Aeropyrum pernix in ima številne potencialne industrijske aplikacije. A. Pernix zaradi svojih lastnosti ni mogoče gojiti v standardnih bioreaktorjih za industrijske fermentacije. Poleg tega je pernisin zahteven tudi za heterologno ekspresijo v mezofilnih heterolognih gostiteljih zaradi sorazmerno kompleksne stopnje, ki je vključena v njegovo aktivacijo. Da bi zagotovili izločanje popolnoma aktivnega encima, smo signalno zaporedje srT iz proteaze S. rimosus spojili s pernizinom. Da bi spodbudili pravilno zlaganje pernizina, smo mesto cepljenja srT spojili neposredno na osnovno pernizinsko zaporedje, s čimer smo izpustili proregijo. Primerjalna biokemijska analiza divjega tipa in rekombinantnega pernizina je potrdila, da encim, ki ga proizvaja S. rimosus, ohrani vse želene lastnosti nativnega pernisina. Pomembno je, da rekombinantni pernizin razgradi celične in infektivne prione, kar je ena izmed posebnih aplikacij te proteaze. Funkcionalni pernizin, ki ohrani vse ugodne lastnosti nativnega encima iz termofilnega gostitelja, je bil uspešno proizveden v heterolognem gostitelju S. rimosus. Pomembno je, da smo dosegli zunajcelično proizvodnjo aktivnega pernizina, kar znatno poenostavi nadaljnje postopke predhodne aktivacije. Pokazali smo, da se S. rimosus lahko uporablja kot gostitelj za industrijsko proizvodnjo rekombinantnih proteinov, ki izvirajo iz termofilnih organizmov.
COBISS.SI-ID: 5116792
Raziskovali smo sedem znanih peptidov, pridobljenih iz različnih proteinov iz hrane, in hidrofoben peptid, pridobljen s pomočjo in-silico hidrolize. Raziskovali smo njihove antioksidativno, protimikrobne in hemolitične dejavnosti in njihove interakcije z vzorcem lipidov membrane. Naši podatki kažejo, da so peptidi s histidini najbolj učinkoviti za zaščito lipidov pred peroksidacijo: P # 3 (VHHA) ) P # 5 (LHALLL) ) P # 7 (LLPHH). Najmočnejši peptid proti kovinsko inducirani oksidaciji je bil P # 2 (LQKW), ki je vseboval aromatski triptofan na C-terminalnem koncu. Peptidi z negativno hidrofobnostjo, kot P # 1 (PEL) in P # 2 (LQKW), so bili najbolj močni antioksidanti glede na DPPH analizo. Peptid z najmočnejšim delovanjem proti superoksidnemu radikalu je bil P#2 sestavljen iz štirih aminokislinskih ostankov, od katerih je bila ena aromatična aminokislina, P # 2 (LQKW). Preučevani peptidi niso pokazali hemolitične ali protimikrobne aktivnosti, razen P # 4 (AAGGV) proti Listeria monocytogenes. Ti peptidi niso interagirali z lipidno membrano, razen P # 8, ki je bil zasnovan za vezavo v lipidni dvosloj. V nadaljevanju smo uporabili pernizin kot proteinazo za pridobivane bioaktivnih peptidov.
COBISS.SI-ID: 5031288
Prispevek je bil objavljen v okviru vabljenega predavanja. Pernizin je subtilizinu podobna proteaza iz hipertermofilne arheje Aeropyrum pernix. Zaradi visoke termične stabilnosti in aktivnosti v prisotnosti denaturantov je pernizin zanimiv encim za uporabo v različnih industrijskih aplikacijah. Sposobnost razgradnje infektivnih prionskih agregatov je ena od uporabnih lastnosti te protease. Pernizin je sestavljen iz signalne sekvence, proregije in katalitične domene. Signalno zaporedje pernizina ga usmeri v zunajcelični prostor, kjer se proregija avtokatalitično razgradi, oz. se odcepi od katalitične domene. Aktivacijo, stabilnost in aktivnost pernizina močno modulirajo kalcijevi ioni. Proizvodnja pernizina v A. pernixu je premajhna za komercialno uporabo. S proizvodnjo rekombinantne oblike pernisina z ekspresijskim sistemom Escherichia coli, smo dosegli višje donose z optimizacijo kodona pernizina. Uspešno smo izvedli proizvodnjo aktivnega rekombinantnega pernzina v Streptomyces rimosus.
COBISS.SI-ID: 5112184
Hipertermofilna arheja Aeropyrum pernix je prilagojena za življenje pri visokih temperaturah, v slanem okolju in pri oksidativnih pogojih. V tej raziskavi smo se osredotočili na antioksidativno aktivnost proteinov iz A. pernix K1. Proteine smo iz biomase A. pernix ekstrahirali v metanolu in vodi pri visoki temperaturi. V ekstraktih smo določili skupne tiolne skupine in antioksidativno učinkovitost. V metanolnem ekstraktu je bila vsebnost skupnih proteinov za 36 % nižja kot v vodnem ekstraktu, prav tako je bilo za 10% manj določenih skupnih tiolnih skupin. Antioksidativna učinkovitost vodnega ekstrakta je bila štirikrat višja kot metanolnega. Proteine smo iz obeh ekstraktov ločili z dvodimenzionalno elektroforezo, izbrane proteine pa analizirali z masno spektrometrijo. Večina identificiranih proteinov sodi med intracelularne proteine, ki so vključeni v oksidativni in osmolarni stresni odgovor. Identificirani smo tudi nekaj proteinov s hidrolitično in dehidrogenazno aktivnostjo.
COBISS.SI-ID: 4877176
Biološke membrane so kompleksni sistemi, ki jih sestavljajo lipidi, proteini in ogljikovi hidrati. Za študij membran uporabljamo lipidne vezikle (liposome), ki so sestavljeni iz fosfolipidnih dvoslojev in služijo kot modelni sistemi za preučevanje različnih funkcionalnih in strukturnih lastnosti. Proučevali smo strukturne lastnosti in fazne prehode različnih glicerofosfolipidov v liposomih. Proučevali smo kako dolžina acilne verige, polarna glava ter esterska ali eterska vez s katero je je acilna skupina vezana na glicerol. Merili smo temperature faznega prehoda, entalpijske spremembe in prepustnosti kalceina. Uporabili smo diferenčno dinamično kalorimetrijo za merjenje temperature in entalpijske spremembe faznega prehoda, s fluorescenčno emisijsko spektrometrijo smo sledili sproščanje kalceina iz liposomov skozi lipidni dvosloj. Naši podatki kažejo, da daljše acilne verige povečajo stabilnost lipidnega dvosloja, medtem ko višje koncentracije soli zmanjšajo toplotno stabilnost in razširijo fazni prehod lipidnega dvosloja.
COBISS.SI-ID: 5081976