Pernizin je zunajcelični subtilizinu-podobna proteinazo iz hipertermofilne arheje Aeropyrum pernix. Izredna stabilnost pri visokih temperaturah in prisotnosti denaturantov je značilnost pernizina zaradi katere je zanimiv tudi za industrijske aplikacije. Ima pa tudi sposobnost, da razgrajuje infektivne prionske agregate. Pernizin je homologen TK-subtilizinu iz Termococcus kodakarensis, ki vsebuje tri insercijska zaporedja in šest dodatnih Ca2 + veznih mesta v primerjavi z mesofilno subtilisins. Ta insercijska zaporedja, skupaj z dodatnimi Ca2 + veznimi mesti, prispevajo k zvijanju in visoki termostabilnosti TK-subtilizina. Pri pernizinu najdemo vse tri insercije in kalcijeva vezna mesta kot pri TK-subtilizinu, vendar pernizin vsebuje dodatno insercijsko zaporedje, ki ga ne najdemo pri ostalih subtilizinu podobnim proteazam. Raziskovali smo vlogo tega edinstvene insercije v zaporedju v pernizinu. Ta insercija je sestavljena iz 8 aminokislinskih ostankov in se nahaja na N-terminalnem delu katalitske domene v pernizinu. Trije ostanki te insercije (D134, V135 in N136) predstavljajo kalcijev vezni motiv DX [D/N] XDG, ki predstavlja dodatno površino zanke, kot je vidno v 3D modelu pernisine. S spektrofluorimetrijo, cirkularnim dihroizmom in poliakrilamidno elektroforezo, smo pokazali, da v primerjavi s pernizinom divjega tipa, varianta z izbrisano insercijo, potrebuje višjo koncentracije kalcijevih ionov, da se pravilno zvije. Poleg tega pernizin z manjkajočo insercijo je manj aktiven in termično stabilen v primerjavi z divjim tipom. Naši rezultati kažejo, da je ta insercija z dodatnim Ca2 + veznim mestom, nujno potrebna za prilagoditev pernizina na skrajna okolja svojega gostitelja organizma A. pernix.
B.03 Referat na mednarodni znanstveni konferenci
COBISS.SI-ID: 5168760Prioni (PrPSc), patološka oblika celičnih proteinov (PrPc), so odgovorni za transmisivne spongiformne encefalopatije. V nasprotju z bakterijami in virusi so prioni izjemno odporni na vse vrste dekontaminacijskih praks in so sposobni tesno vezavo na površine, vključno s tistimi iz nerjavečega jekla, kjer lahko še naprej obstojajo in ohranijo infektivnost dolgo časa . Naš cilj je bil razviti učinkovit postopek dekontaminacije, ki temelji na encimih, proizvedenih v bakterijskem heterolognem sistemu izražanja, ki bi se uporabljal tudi na občutljivih in dragih medicinskih instrumentih in opremi. V ta namen smo testirali pernizin, termostabilno serinske proteaze, ki jo proizvaja ekstremofilna arheja, Aeropyrum pernix, in več rekombinantnih oblik proizvedenih v Escherichia coli in S. rimosus. Aktivnost teh encimov je bila testirana z Western blotom z uporabo normalnim govejim možganom za razgradnjo PrPc in govejim možganom, okuženim z govejo spongiformno encefalopatijo (BSE) za razgradnjo PrPSc. Pernizin popolnoma razgradi PrPc in PrPSc, medtem ko so rekombinantne oblike dale različne rezultate. Dve stae razgradili PrPc in PrPSc, vendar je bilo treba optimizirati encim/substrat razmerje, za ustrezen učinek. Treba je bilo uporabiti približno trikrat višjo koncentracijo rekombinantnega proteina za pridobitev primerljive aktivnosti kot z divjim tipom pernizina. Predhodni rezultati kažejo, da ima pernizin sposobnost učinkovite dekontaminacije. Nekateri rekombinantni protein, pa kazejo obetavne rezultate, vendar bo potrebno nadaljnje delo za razvoj encimskega sistema, ki bi bil enako učinkovit in primeren za industrijsko uporabo.
B.03 Referat na mednarodni znanstveni konferenci
COBISS.SI-ID: 4761466Na kongresu FEBS3+, v katerem organizacijskem komiteju sem bila tudi sama, smo predstavili naše rezultate dobljene za pernizin, ki smo ga proizvedli v Streptomicetah. Rekombinantni pernizin je bil aktiven, kar smo potrdili z njegovo učinkovitostjo razgradnje infektivnih prionov. Poročali smo o postopku ekspresije, čiščenja, izolacije in delovanja pernizina.
C.07 Drugo uredništvo
COBISS.SI-ID: 4943992Magisterska naloga je bila nagrajena kot Fakultetna Prešernova nagrada. Pernizin je zunajcelična serinska proteinaza, ki jo sintetizira hipertermofilna arheja Aeropyrum pernix. Za razvoj komercialnih aplikacij in nadaljnji opis pernizina je ključen razvoj učinkovitega rekombinantnega ekspresijskega sistema. Kodonsko optimizirano zaporedje za pernizin smo vstavili v vektorje pMCSG7 in pMD204, s tem smo pripravili ekspresijske vektorje za prekomerno izražanje gena za pernizin v Escherichia coli. Optimalna čistost pernizina je bila dosežena z usmerjeno akumulacijo encima v periplazmi. Po izolaciji iz periplazemske frakcije in čiščenju encima označenega s histidinsko značko z Ni-NTA afinitetno kromatografijo je bil dosežen donos ~4 mg pernizina na L produkcijske kulture. Za aktivacijo encimske aktivnosti pernizina je potrebna avtokatalitična odcepitev proregije. Glede na predvidena cepitvena mesta post-translacijskega zorenja smo sintetizirali neprocesiran pernizin (Prn1), encim brez signalne sekvence (Prn26) ter procesiran encim brez proregije (Prn92 ; Prn94). S cimografijo smo potrdili uspešno zvitje vseh različic rekombinantnega pernizina v proteolitično aktivno obliko. To nakazuje, da proregija pri pernizinu ni nujna za uspešno zvitje, kot velja za nekatere subtilaze. S CD-spektropolarimetrijo in fluorescenčno emisijsko spektrometrijo smo potrdili visoko termostabilnost rekombinantnega pernizina ter pokazali visoko encimsko aktivnost pri temperaturi 100 °C z azokazeinskimi testi. Ugotovili smo, da med postopki produkcije in biokemijske karakterizacije v vzorcih pernizina poteka nezaželena avtoproteoliza. Vezava kalcijevih ionov (Ca2+) povzroči konformacijske spremembe v strukturi pernizina, verjetno preko tvorbe Ca2+-vezavne zanke. Vezava kalcijevih ionov zviša konformacijsko stabilnost in proteolitično aktivnost, kar posledično zviša tudi stopnjo avtokatalitičnega zorenja in avtoproteolize v raztopinah pernizina.
E.01 Domače nagrade
COBISS.SI-ID: 8993657Kot predstavnica SBD sem bila vabljena predavateljica na Mednarodnem kongresu Srbskega biokemijskega društva. v Beogradu
B.04 Vabljeno predavanje
COBISS.SI-ID: 5122680