Z AMP aktivirana protein-kinaza (AMPK) je glavni regulator energijskega metabolizma in obetavna tarča za razvoj novih zdravil za zdravljenje sladkorne bolezni tipa 2 in raka. 5-aminoimidazol-4- karboksamid-1-ß-D-ribofuranozid (AICAR), analog adenozina, je standardna pozitivna kontrola za merjenje aktivacije AMPK s celičnimi testi. Nekateri mediji, ki se v splošnem uporabljajo za gojenje celičnih kultur, kot npr. MEM?, vsebujejo visoke koncentracije adenozina in drugih nukleozidov. Raziskali smo, ali takšni mediji vplivajo na aktivnost spojine AICAR v skeletnih in rakastih celicah. V mediju brez nukleozidov je AICAR spodbudil aktivacijo AMPK, povečal prevzem glukoze in zavrl celično proliferacijo. Ti učinki so bili v primeru medija MEM? z nukleozidi precej omiljeni ali celo zavrti. Tudi dodatek adenozina ali 2’-deoksiadenozina v medij brez nukleozidov je zavrl delovanje spojine AICAR. MEM? z nukleozidi je zavrl aktivacijo AMPK celo v prisotnosti metotreksata, ki navadno močno spodbudi aktivnost spojine AICAR. Druge sestavine medija kot npr. vitamin B12, vitamin C in ?-lipoična kislina, so imele le manjši učinek na aktivnost spojine AICAR. Naše ugotovitve so pokazale, da medij z nukleozidi, ki se pogosto uporablja za raziskovanje AMPK, zavira delovanje spojine AICAR, ki je farmakološki aktivator omenjene kinaze. Rezultati pridobljeni s pomočjo celičnih testov za katere se uporablja AICAR kot aktivator AMPK, so torej zelo odvisni od sestave medija. Poleg tega naše ugotovitve prispevajo k razumevanju regulatorne vloge zunajceličnih nukleozidov in nukleozidnih transporterjev v zvezi z aktivacijo AMPK.
COBISS.SI-ID: 33945305
Kardiotonični steroidi (KTS), kot sta ouabain in marinobufagenin, so domnevno hormoni skorje nadledvičnice in se izločajo med telesno vadbo ali kot odziv na stres. Katalitična ?-podenota Na,K-ATPaze (NKA) je receptor za KTS. Ker se največ NKA nahaja v skeletnih mišicah, bi lahko bile le-te glavna tarča KTS. Skeletne mišice prispevajo k prilagoditvi na telesno vadbo z izločanjem interlevkina 6 (IL-6) in številnih drugih citokinov, ki prožijo parakrine in endokrine učinke v mišicah in nemišičnih tkivih. Ugotavljali smo, ali ouabain, kot prototip KTS, v kulturi humanih skeletnomišičnih celic modulira signaliziranje in izločanje IL-6. Ouabain (2,5 – 50 nM) je znižal raven STAT3, ki je ključen transkripcijski dejavnik na koncu signalne poti receptorja IL-6, njegovega transkripta ter njegove bazalne in z IL-6 stimulirane fosforilacije. Nasprotno je ouabain (50 nM) povečal fosforilacijo ERK1/2, Akt, p70S6K in S6 ribosomalnega proteina, kar kaže na aktivacijo poti ERK1/2 in Akt-mTOR. Inhibitor proteasoma MG- 132 je preprečil z ouabainom povzročeno znižanje celokupnega STAT3, vendar ni preprečil defosforilacije STAT3. Ouabain (50 nM) je zavrl hipoksični inducibilni dejavnik-1? (HIF-1?), modulator STAT3, vendar pa utišanje gena za HIF-1? in/ali njegove partnerske beljakovine HIF-1ß ni posnemal učinka ouabaina na fosforilacijo STAT3. Ouabain (50 nM) ni zavrl fosforilacije STAT3 in HIF-1? v podganjih skeletnomišičnih celicah L6, katerih ?1-podenota NKA je neodzivna na ouabain. Ugotovili smo tudi, da ouabain (100 nM) spodbuja izločanje IL-6, IL-8, GM-CSF in TNF-? iz skeletnomišičnih celic zdravih oseb in izločanje GS-CSF iz celic bolnikov s sladkorno boleznijo tipa 2. Marinobufagenin (10 nM), še eden od pomembnih KTS, ni vplival na izločanje citokinov. Ključna ugotovitev naše študije je, da ouabain prek STAT3 zavira signaliziranje IL-6, a hkrati spodbuja izločanje IL-6 in drugih citokinov, kar bi lahko predstavljalo negativno povratno zvezo na poti IL-6/STAT3. V celoti gledano naši rezultati govorijo v prid vlogi KTS in NKA.
COBISS.SI-ID: 29834243
S krčenjem povezane prilagoditve v skeletnih mišicah in vivo so dobro opisane, celični mehanizmi za temi prilagoditvami pa še niso povsem jasni. Kulture humanih cevčic predstavljajo zelo pomemben modelni sistem za humano skeletno mišico, vendar se ne krčijo, če jih ne stimuliramo. Krčenje lahko stimuliramo z inervacijo humanih cevčic in vitro, tako da jih gojimo skupaj z hrbtenjačo iz podganjih embrijev, ali z električnimi pulzi. Preverili smo učinke obeh in vitro pristopov, inervacije in stimulacije z električnimi pulzi (EPS), na izražanje težkih verig miozina (MyHC) in na metabolizem glukoze in oleinske kisline v kulturah humanih cevčic. Pritrjene humane cevčice smo bodisi inervirali s segmenti hrbtenjače podganjih embrijev bodisi smo jih stimulirali z električnimi pulzi. Izražanje MyHC smo preverili s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo, prenosom western in imunofluorescenčnim barvanjem, metabolizem glukoze in oleinske kisline pa smo preučevali z uporabo radioaktivno označenih substratov. Inervacija in EPS sta spodbudila diferenciacijo proti različnim tipom mišičnih vlaken. Izražanje počasne izooblike MyHC-1 se je znižalo v inerviranih cevčicah, EPS pa na izražanje izooblike MyHC-1 ni imel učinka. Izražanje obeh hitrih izooblik (MyHC-2A in MyHC-2X) se je nekoliko znižalo v celicah, tretiranih z EPS. Oba pristopa sta spodbudila oksidativen fenotip, na kar kaže povečano sproščanje CO2 pri presnovi glukoze in oleinske kisline. Novost: Inervacija in EPS spodbujata diferenciacijo humanih cevčic v različne tipe mišičnih vlaken. Tako inervacija kot EPS spodbujata oksidativni metabolizem humanih cevčic.
COBISS.SI-ID: 24641539
Denervacija zmanjša vsebnost Na+,K+-ATPaze (NKA) v skeletni mišici, medtem ko jo reinervacija poveča. Primarne humane skeletnomišične celice, ki so najpogosteje uporabljen model za preučevanje humane skeletne mišice in vitro, ponavadi gojimo kot mioblaste ali mišične cevčice brez nevronov in običajno spontano ne kontrahirajo, kar bi lahko vplivalo na njihovo sposobnost izražanja in regulacije NKA. Preučili smo, kako diferenciacija, de novo oživčenje (inervacija) in električna pulzna stimulacija (EPS) vplivajo na izražanje podenot NKA (? in ß) in regulatornih molekul NKA FXYD1 (fosfoleman) in FXYD5 (dizadherin). Diferenciacija mioblastov v mišične cevčice ob nizki koncentraciji seruma je povečala izražanje miogenih označevalcev CD56 (NCAM1), dezmina, težkih miozinskih verig, dihidropiridinskih receptorskih podenot ?1S in SERCA2 ter NKA?2 in FXYD1, medtem ko je zmanjšala izražanje FXYD5 mRNA. Mišične cevčice, inervirane de novo z motonevroni v kokulturi z eksplantati podganje embrionalne hrbtenjače, so se začele spontano krčiti med 7. in 10. dnem. V kratkotrajnih kokulturah (10 - 11 dni) je prišlo do spodbujenega izražanja mRNA miokinov, kot so IL-6, IL-7, IL-8 in IL-15, vendar pa ni bilo vpliva na izražanje mRNA NKA, FXYD ali miokinov, kot so musklin, katepsin B, meteorinu podobne beljakovine ali SPARC. V dolgotrajnih kokulturah (21 dni) je prišlo do povišanja beljakovin NKA?1, NKA?2, FXYD1 in fosfo-FXYD1Ser68 brez sprememb v ravni mRNA. Zavrtje živčnomišičnega prenosa z ?-bungarotoksinom ali tubokurarinom za 24 h ni spremenilo izražanja mRNA za NKA ali FXYD. Električna pulzna stimulacija (48 h) neoživčenih mišičnih cevčic je spodbudila izražanje mRNA za NKAß2, NKAß3, FXYD1 in FXYD5. Za zaključek, nizka koncentracija seruma spodbuja izražanje NKA?2 in FXYD1, medtem ko de novo inervacija ni bistvena za zvišanje NKA?2 in FXYD1 mRNA v kulturi mišičnih cevčic. Čeprav inervacija in EPS obe spodbudita krčenje mišičnih cevčic, prožita različne učinke na izražanje NKA in FXYD.
COBISS.SI-ID: 53364483
Značilnosti sistemske skleroze (SSc) so avtoimunost, mikroangiopatija in fibroza. Kožno fibrozo spremlja izginotje belega maščobnega tkiva v koži ter spremembe nivoja in funkcije adiponektina. Ker te ugotovitve v patogenezo SSc vključujejo tudi adiponektin, smo uporabili nov farmakološki pristop za povečanje signalizacije adiponektina z uporabo AdipoRon-a, oralno delujočega agonista receptorjev za adiponektin. Kronično zdravljenje z AdipoRon-om je pri miših v kožni leziji znatno izboljšalo dermalno fibrozo, izzvano z bleomicinom. AdipoRon je zmanjšal aktivacijo fibroblastov, transdiferenciacijo adipocitov v miofibroblaste, polarizacijo imunskega odziva v Th2 / Th17, žilno poškodbo in transdiferenciacijo endotelija v mezenhim. In vitro je AdipoRon zmanjšal z TGF-ß izzvane profibrotične odzive v normalnih fibroblastih, in zmanjšal označevalce aktiviranega profibrotičnega fenotip SSc fibroblastov. Glede na te ugodne učinke na vse tri kardinalne patomehanizme, na katerih temeljijo klinične manifestacije SSc, bi lahko farmakološko povečanje signalizacije adiponektina predstavljalo novo strategijo zdravljenja SSc.
COBISS.SI-ID: 33899225