Genetska identifikacija skeletnih ostankov, najdenih v množičnih grobiščih druge svetovne vojne, je zapletena zaradi slabe kakovosti vzorcev. Cilj te študije je bil uvesti potek dela za tipizacijo področij STR pri starih vzorcih kosti s kombiniranjem tehnologije PCR/CE in PCR/NGS. V ta namen smo preučili 57 vzorcev DNA, pridobljenih iz 75 let starih stegnenic. Po tipizaciji s kompletom GlobalFiler in kapilarno elektroforezo (CE) je 42 vzorcev dalo kompleten profil in te vzorce lahko preiskujemo po standardnem postopku. 15 vzorcev, ki niso dali nobenega ali le omejeno število (2–17 / 21) uspešno pomnoženih avtosomnih označevalcev STR in štiri kontrolne vzorce kosti, ki so zagotovili kompleten genetski profil s standardnim testom PCR/CE, smo duplicirano tipizirali s kompletom GlobalFiler NGS. Kljub degradaciji vzorcev, ki je povzročila manjšo pokritost in manjši odstotek sekvenčnih odčitkov, smo zanesljive podatke o nukleotidnem zaporedju pridobili iz 16/19 vzorcev. Z uporaba 30 × praga pokritosti za interpretacijo genotipov področij STR smo uspeli določiti konsenzusni profil (cp) z 20–31 / 31 STR avtosomnih lokusov v 10 vzorcih in do cp 8–10 / 31 lokusov v dveh vzorcih, medtem ko so štirje kontrolni vzorci so dali cp s 26–31 / 31 lokusov. Na koncu smo podatke o tipizaciji področij STR, pridobljene z NGS kombinirani s podatki o tipizaciji STR s CE. Tako smo v povprečju pridobili informacijo za dodatne tri alele na vzorec in povečali število heterozigotnih vzorcev v 37 primerih. Predlagani kombinirani pristop je omogočil genetsko tipizacijo 65–100% avtosomnih označevalcev STR v 10/15 (66,6%) skeletnih ostankih, ki s konvencionalnim pristopom PCR/CE niso dali nobenih ali zelo slabe rezultatoe. Opazili smo tudi artefakte (na primer izpadel ali vrinjen alel), zato ni mogoče popolnoma zanemariti nevarnosti možnosti napačne tipizacije katerega od alelov.
COBISS.SI-ID: 34066179
Vsebnost DNA se razlikuje glede na anatomsko regijo, zato je izbira tipa skeletnih elementov, ki omogočajo pridobitev največje količine DNA, pomembna za uspešnost identifikacije skeletnih ostankov. Cilj naše študije je bil raziskati med- in znotraj-individualne razlike v vsebnosti DNA z merjenjem količine in kakovosti jedrne DNA in uspehom tipizacije avtosomnih označevalcev STR, z namenom, da bi določili najbolj obetavne skeletne elemente za vzorčenje kosti za identifikacijske namene. Da bi čim bolj izključili vpliv tafonomskih procesov in z njimi povezanih vprašanj, smo preiskavo opravili na treh kompletnih moških skeletih iz istega množičnega grobišča druge svetovne vojne in analizirali vse reprezentativne tipe skeletnih elementov človeškega telesa. Iz vsakega skeleta smo odvzeli oseminštirideset različnih tipov kosti in sicer glave, trupa, okončin, dlani in stopala, skupaj 144 kosti. Vzorce smo očistili in pol grama kostnega prahu dekalcificirali z uporabo metode popolne demineralizacije. DNA smo očistili v napravi Biorobot EZ1 (Qiagen). Vsebnost DNA in stopnjo njene razgrajenosti smo določili s kompletom PowerQuant (Promega), za tipizacijo označevalcev STR pa smo uporabili komplet Investigator ESSplex SE QS (Qiagen). Kosti z največjo količino izolirane DNA so večinoma dale najbolj kompletne profile STR. Med skeletnimi elementi, ki vsebujejo v povprečju največ DNA in dajejo najbolj popolne profile v vseh treh pregledanih skeletih so bile dlančnice, stopalnice in skalnice temporalne kosti. Dlančnice in stopalnice je mogoče enostavno vzorčiti brez uporabe žage in tako zmanjšati potencialno kontaminacijo DNA. Skelete iz obdobja druge svetovne vojne lahko uporabimo kot model slabo ohranjenih skeletnih ostankov, rezultate preiskave pa lahko apliciramo v rutinske forenzično genetske preiskave močno razgrajenih skeletnih ostankov. Čeprav je bila raziskava omejena le na tri skelete, najdene v istem množičnem grobišču, lahko pridobljeni podatki prispevajo k strategiji vzorčenja kosti za genetsko identifikacijo starih skeletnih ostankov. V prihodnosti bomo analizirali še več skeletov iz druge svetovne vojne, da bi dodatno raziskali med-kostne razlike pri ohranjanju DNA.
COBISS.SI-ID: 39471619
Poboji med drugo svetovno vojno s skoraj sto tisoč žrtvami so ena največjih izgub življenj v sodobni slovenski zgodovini. Članek predstavlja genetsko identifikacijo žrtev največjega družinskega poboja v Sloveniji, v katerem je bilo ubitih 10 članov iste družine. Sedem jih je bilo pokopanih v prikriti množični grob, preživela sta le dva otroka, ki sta nam služila kot primerjalna vzorca. V letih 2015 in 2016 so našli dva groba in izkopali tri nepopolne ženske skelete ter vsaj tri nepopolne moške skelete. Skupno smo analizirali 12 kosti in zob in jih primerjali z dvema še živečima sorodnikoma. Izolirano DNA smo količinsko opredelili s pomočjo kompleta PowerQuant, za tipizacijo označevalcev STR pa smo uporabili različne avtosomne ??in Y-STR komplete. Iz analiziranih vzorcev smo pridobili do 2,7 ng DNA/g kostnega ali zobnega prahu. Iz sedmih kosti in enega kočnika nam je uspelo pridobiti zadostno količino jedrne DNA za uspešno tipizacijo označevalcev STR. Iz ženskega groba so bili avtosomni genetski profili pridobljeni samo iz enega skeleta, iz moškega groba pa iz petih od skupno šestih stegnenic. Genetska povezanost med moškimi skeleti in primerjalnimi vzorci je bila dodatno potrjene z analizami označevalcev STR na kromosomu Y. Pridobljeni profili STR so omogočili identifikacijo štirih družinskih članov; eno od tet iz ženskega groba, dva strica in očeta preživelih otrok pa iz moškega groba. Pravilo produkta je bilo uporabljeno za izračun skupnega razmerja verjetnosti identifikacije za avtosomne ??in Y-STR označevalce, statistične analize pa so pokazale visoko stopnjo zaupanja v pravilno identifikacijo, saj je bila verjetnost identifikacije večja od 99,9% za tri od štirih identificiranih žrtev. Za identifikacijo tete je bil verjetnost, dobljena po tipizaciji s kompletoma ESI-17 in NGM, prenizka. Za povečanje verjetnosti smo uporabili komplet Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel, ki temelji na tehnologiji naslednje generacije sekvenciranja (NGS). Po analizi dodatnih označevalcev STR je statistična analiza pokazala verjetnost večjo od 99,9%, kar kaže na to, da je bilo raziskano zadostno število genetskih označevalcev za pozitivno identifikacijo skeletnih ostankov tete. Za zagotovitev sledljivosti v primeru pojava kontaminacije je bila ustvarjena izločitvena baza podatkov, ki vsebuje genetske profile vseh posameznikov, ki smo bili v stiku s skeletnimi ostanki. Ujemanj nismo zasledili. Po več kot 70 letih so skeletne ostanke vrnili preživelima otrokoma, ki sta svoje sorodnike pokopala v družinskem grobu.
COBISS.SI-ID: 34586073
Poglavje v knjigi predstavlja analize skeletnih ostankov iz obdobja druge svetovne vojne s tehnologijo, ki jo uporabljamo v forenzičnih preiskavah. Stare kosti so za tipizacijo DNA zelo zahtevni biološki vzorci, saj vsebujejo zelo malo DNA, ki je močno razgrajena. Izjemno tveganje za kontaminacijo s sodobno humano DNA (pri čemer gre za kontaminacijo z DNA oseb, ki sodelujejo pri izkopavanjih, antropoloških analizah in genskih testiranjih) in prisotnost zaviralcev pomnoževanja DNA v reakciji PCR še dodatno omejujeta uspeh tipizacije DNA. Da bi preprečili in izsledili morebitno kontaminacijo s sodobno DNA, uporabljamo številne standardne previdnostne ukrepe in jih v poglavju opisujemo. Obravnavana je sestava kosti in zob ter postopek njihove razgradnje v naravnem okolju. Poleg morfološke zgradbe je posebna pozornost namenjena dejavnikom, ki vplivajo na ohranitev DNA v starih kosteh in zobeh. Na podlagi pregledane literature in opravljenih preiskav poglavje povzema, kateri skeletni elementi so najprimernejši za raziskovanje skeletnih ostankov druge svetovne vojne. Razpravlja o tem, kako očistiti in zmleti vzorce kosti in zob, kako iz pridobljenega prahu izolirati DNA in kako določiti kakovost in količino izolirane DNA s pomočjo kvantifikacije z reakcijo PCR v realnem času. Opisani so genetski označevalci, ki jih najpogosteje preiskujemo pri analizah DNA, pridobljene iz skeletov iz obdobja druge svetovne vojne. Obravnavamo tudi prednosti novih, visoko učinkovitih tehnik sekvenciranja za razvoj in preučevanje iz starih skeletov pridobljene DNA. Uporaba inovativnih metod, ki lahko pomagajo pri pridobivanju velikih količin bolj kakovostnih podatkov, omogoča podrobnejše raziskovanje močno degradirane DNA. Shranjevanje vzorcev je še posebej pomembno v laboratorijih, ki se ukvarjajo s forenzično genetiko. Učinkovito dolgoročno shranjevanje kosti je potrebno, da se zagotovi stabilnost vzorca skozi čas, tako da se lahko za nadaljnje ponovno testiranje uporabljajo novi genetski označevalci in nove tehnologije. Zato so predstavljeni tudi rezultati nekaterih študij shranjevanja vzorcev starih kosti. Poglavje zaključimo s predstavitvijo identifikacij žrtev druge svetovne vojne v Sloveniji.
COBISS.SI-ID: 42457859
Preiskave skeletnih ostankov žrtev druge svetovne vojne so zahtevne zaradi omejene vsebnosti DNA, ki jo uspemo pridobiti iz starih kosti. Forenzične raziskave se v glavnem osredotočajo na iskanje tipov skeletnih elementov, v katerih se DNA najbolje ohrani, malo pa je znanega o znotraj-kostni variabilnosti. Dlančnice in stopalnice so se pri preiskavi vseh reprezentativnih skeletnih elementov treh žrtev druge svetovne vojne izkazale kot kosti z največjo vsebnostjo DNA, vendar znotraj-kostna variabilnost ni bila raziskana. Ugotovljeno je bilo, da ostanki mehkih tkiv prispevajo k večjim količinam DNA v trabekularnem kostnem tkivu. Ker so dlančnice in stopalnice sestavljene iz trabekularnih epifiz in gostih diafiz, je bil cilj študije raziskati variabilnost v vsebnosti DNA znotraj dlančnic in stopalnic. Količino in kakovost jedrne DNA smo določili s qPCR kompletom PowerQuant System (Promega). Pregledali smo 193 kosti iz masovnega grobišča iz obdobja druge svetovne vojne. Iz vsake kosti smo pridobili DNA iz kompaktne diafize in iz obeh gobastih epifiz, ki smo ju združili. Študija je pokazala večjo količino DNA v epifizah pri vseh analiziranih kosteh, pri čemer smo več DNA pridobili iz epifiz dlančnic kot iz epifiz stopalnic. Kadar pri identifikaciji skeletnih ostankov obstaja možnost za vzorčenje dlančnic in stopalnic priporočamo vzorčenje dlančnic. V primerih, ko skelet ni kompleten in manjkajo roke, priporočamo vzorčenje stopalnic. Tako pri dlančnicah kot stopalnic so epifize bogatejši vir DNA kot diafize.
COBISS.SI-ID: 53039107