Na svetovni konferenci v Pragi smo predstavili razlike v količini pridobljene DNA v šestih različnih skeletnih elementih osmih arheoloških skeletov. Trenutna strategija vzorčenja za laboratorije, ki tipizirajo kosti z namenom genetske identifikacije, vključujejo vzorce, pridobljene iz stegnenice, zoba in temporalne kosti. Najnovejše študije kažejo, da so bile majhne kosti dlani in stopal zelo podobne ali celo boljše pri donosu DNA. Te kosti je mogoče enostavno vzorčiti s skalpelom za enkratno uporabo in tako zmanjšati potencialno kontaminacijo DNA. Cilj naše študije je bil ugotoviti primernost stopalnic, dlančnic in prstnic za genetsko identifikacijo. Na 5 arheoloških najdiščih v Sloveniji je bilo pridobljenih 48 vzorcev kosti iz 8 različnih skeletov (šest iz 18. stoletja in dva iz 3. stoletja). Iz vsakega skeleta je bilo vzorčenih 6 različnih skeletnih elementov (skalnica senčnice, kočnik, stegnenica, dlančnica, stopalnica in proksimalna prstnica roke), sledili pa so strogi varnostni ukrepi za preprečevanje kontaminacije. Polovico grama kostnega in zobnega prahu smo dekalcificirali z uporabo metode popolne demineralizacije. DNA smo očistili v napravi Biorobot EZ1 (Qiagen), vsebnost DNA določili s kompletom PowerQuant (Promega) in tipizacijo avtosomnih označevalcev STR izvedli s kompletom Investigator ESSplex Plus (Qiagen). Iz analiziranih vzorcev smo pridobili do 8,75 ng DNA/g kostnega in zobnega prahu. Najvišjo količino DNA smo pridobili iz skalnice senčnice, najnižjo pa iz stegnenic. Stopnjo uspešnosti tipizacije označevalcev STR smo ocenili glede na število uspešno tipiziranih označevalcev in potrdili močno korelacijo med stopnjo uspešnosti tipizacije označevalcev STR in količino ekstrahirane DNA. Za vseh osem arheoloških skeletov smo uspeli iz analiziranih skeletnih elementov določiti kompletne konsenzusne genetske profile. Naše ugotovitve kažejo, da bi bilo primerno vključiti dlančnice in stopalnice v strategijo vzorčenja za genetsko identifikacijo, čeprav so za utemeljitev ugotovitev te študije potrebne nadaljnje raziskave.
B.06 Drugo
COBISS.SI-ID: 34532825V Laboratoriju za molekularno genetiko, Inštituta za sodno medicino, Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani je bila pod mentorstvom vodje projekta opravljena Prešernova naloga, ki je bila nagrajena s strani Medicinske fakultete s fakultetno Prešernovo nagrado za leto 2017. Raziskovali smo, ali so za genetsko tipizacijo starih skeletnih ostankov poleg priporočljivih kosti (senčnica, stegnenica in zob) primerne tudi drobne kosti dlani in stopal (dlančnice, stopalnice in prstnice). Postavili smo si tri hipoteze (1. količina ohranjene starodavne DNA iz senčnic, zob in stegnenic je primerljiva tisti v drobnih kosteh končnih delov udov (dlančnice, stopalnice in prstnice), 2. uspešnost tipizacije področij STR starodavne DNA iz senčnic, zob in stegnenic je primerljiva tisti iz drobnih kosti končnih delov udov in 3. uspešnost tipizacije področij STR starodavne DNA je močno povezana s količino izolirane starodavne DNA). V raziskavo je bilo vključenih 93 vzorcev kosti iz 13 skeletov iz slovenskih arheoloških najdišč. Pri vsakem skeletu smo vzorčili 6 skeletnih elementov (senčnica, zob, stegnenica, dlančnica, stopalnica in prstnica). Pri vsakem izmed 13 skeletov smo uspeli pridobiti kompletni ali vsaj delni genetski profil iz najmanj enega analiziranega skeletnega elementa. Za genetsko tipizacijo ni bilo primernih približno polovica vzorcev. Rezultati so potrdili vse tri hipoteze. Količina ohranjene starodavne DNA iz senčnic, zob in stegnenic je bila primerljiva s tisto iz drobnih kosti končnih delov udov. Enako velja za uspešnost tipizacije področij STR starodavne DNA, ki je primerljiva med preiskovanimi skeletnimi elementi. Uspešnost tipizacije področij STR in količina izolirane DNA za posamezni skeletni element sta bili močno povezani. Ugotovili smo, da bi bilo za genetsko tipizacijo starih skeletov smiselno poleg senčnic, stegnenic in zob vzorčiti tudi stopalnice, dlančnice in prstnice. Za zanesljivejše zaključke bi bilo potrebno obdelati večje število skeletov in hkrati razširiti nabor drobnih kosti dlani in stopal.
E.01 Domače nagrade
COBISS.SI-ID: 3898388Na konferenci na Portugalskem smo predstavili visoko učinkovito ekstrakcijsko metodo, ki smo jo razvili v našem laboratoriju za pridobitev DNA iz starih človeških skeletnih ostankov. Za oceno ekstrakcijske metode smo obdelali preko 150 kosti in zob iz obdobja druge svetovne vojne. Prikazali smo postopke za obdelavo kosti (mehansko in kemično čiščenje, rezanje in mletje v prah ob prisotnosti tekočega dušika), popolno demineralizacijo kostnega in zobnega prahu, ekstrakcijo DNA, čiščenje DNA s tehnologijo magnetnih delcev, kvantifikacijo in tipizacijo DNA. Opisali smo najprimernejše tipe kosti in zob za genetske analize in ukrepe za preprečevanje kontaminacije v genetskem laboratoriju. Predstavili smo tudi nekaj primerov identifikacij žrtev masovnih grobišč iz obdobja druge svetovne vojne.
B.03 Referat na mednarodni znanstveni konferenci
COBISS.SI-ID: 33673177V oktobru 2017 smo v Laboratoriju za molekularno genetiko, Inštituta za sodno medicino, Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani, pod organizacijo in vodstvom vodje projekta izvedli 3-dnevno mednarodno izobraževalno delavnico “Ancient DNA extraction course”, ki so se je udeležili forenzični raziskovalci iz Italije. Delavnica je bila zasnovana na eksperimentalnem individualnem delu s starodavnimi kostmi in je udeležencem omogočila neposreden pristop k DNA-tipizaciji kosti. Udeleženci so sami izvedli obdelavo kosti (mehanično in kemično čiščenje, rezanje in mletje v prah v prisotnosti tekočega dušika), dekalcifikacijo kostnega prahu, ekstrakcijo DNA, čiščenje DNA, kvantifikacijo DNA z metodo PCR v realnem času, DNA-tipizacijo jedrnih področij STR, elektroforetsko ločevanje pomnoženih fragmentov in oceno rezultatov tipizacije DNA. Delavnica je bila zasnovana tako, da je omogočila višji nivo izobraževanja že izkušenim raziskovalcem, ki poznajo tehnologijo tipizacije DNA. Delavnico smo izvedli v forenzičnem molekularnogenetskem laboratoriju, ki je opremljen in namenjen izključno obdelavi starih kosti in zob.
F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference)
COBISS.SI-ID: 33490649V Laboratoriju za molekularno genetiko, Inštituta za sodno medicino, Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani je bila pod mentorstvom vodje projekta opravljena magistrska naloga. V genetskih sodnomedicinskih preiskavah predstavlja identifikacija pogrešanih oseb še vedno izziv, saj so skeletizirani posmrtni ostanki, na katere smo se v magistrski nalogi osredotočili, pogosto v slabem stanju, težaven pa je tudi izbor skeletnih elementov, ki bi omogočili pridobitev kar se da kvalitetnih rezultatov. Na ohranjenost deoksiribonukleinske kisline (DNA) v skeletnih ostankih vplivajo individualno specifični dejavniki (spol, starost), bolj pa dejavniki okolja ter čas od smrti do najdbe. V nalogi smo z analizo treh približno 70 let starih skeletov iz prikritega povojnega grobišča Huda jama (skupno smo preiskovali 168 skeletnih elementov) s pomočjo različnih parametrov, kot so količina DNA, stopnja degradacije le-te in uspešnost njene tipizacije, iskali skeletne elemente, ki bi bili za identifikacijo žrtev druge svetovne vojne najbolj primerni. Analiza je obsegala čiščenje in mletje kosti in zob, ekstrakcijo in čiščenje DNA, določitev količine DNA v ekstraktih z metodo verižne reakcije s polimerazo (PCR) v realnem času, PCR - pomnoževanje in analizo specifičnih področij kratkih tandemskih ponovitev (lokusi STR) in pridobitev ter interpretacijo avtosomskih genetskih profilov. Najbolj povedna parametra sta količina DNA v nanogramih na gram kostnega in zobnega prahu in uspešnost tipizacije, ki smo jo definirali kot število uspešno pomnoženih lokusov STR za posamezni skeletni element pri treh analiziranih skeletih. Kot najprimernejše skeletne elemente smo določili vse dlančnice (I-V), vse stopalnice (I-V), intermedialno klinasto kost stopala, distalno prstnico palca noge, skočnico, senčnico (skalnico) in golenico, ki so pri vseh preiskovanih skeletih dali kompletne genetske profile. Seznam lahko razširimo na 25 skeletnih elementov - dodamo tiste, ki so dali delne profile z izpadom enega samega lokusa STR: glavatico, proksimalno prstnico palca roke, proksimalno prstnico palca noge, medialno klinasto kost, pogačico, čolnič, distalno prstnico palca roke, petnico, lateralno klinasto kost in kocko. Ustvarili smo eliminacijsko zbirko z genetskimi profili oseb, ki smo sodelovale na vseh stopnjah rokovanja z vzorci ter primerjali profile s profili treh analiziranih skeletov in ob neujemanju izključili možnost kontaminacije.
D.10 Pedagoško delo
COBISS.SI-ID: 4611185