Holesterol je esencialen za razvoj, rast in vzdrževanje organizma. Mutacije v genih sintezne poti holesterola so usodne za razvoj embrija in le nekaj polimorfizmov je do danes povezanih s patološkim vplivom pri človeku. Analize polimorfizmov lanosterol 14?-demetilaze (CYP51A1) iz poznega dela sintezne poti holesterola kažejo na nekaj drugačnosmiselnih mutacij z nizko frekvenco recesivnih alelov in malo povezav mutacij s patologijo pri človeku. Cilj raziskave je opredeliti vlogo zamenjav aminokislin, ki so posledica naravnih drugačnosmiselnih mutacij proteina CYP51A1. Preiskali smo bazo zamenjav posameznega nukleotida SNP za naravne polimorfizme gena CYP51A1 in predelili njihov vpliv na funkcijo proteina. Odkrili smo redke variante s škodljivo napovedno vrednostjo drugačnosmiselne mutacije CYP51A1, med njimi so nekatere že povezane s fenotipom pri človeku. Dve varianti proteina z drugačnosmiselno mutacijo smo pripravili, da bi preverili encimsko aktivnost in vitro, vendar nismo uspeli pridobiti značilnega spektra P450. Izvedli smo molekulsko modeliranje treh drugačnosmiselnih variant za opredelitev vpliva zamenjave aminokisline na interakcijo s substratom in redoks partnerjem P450 oksireduktazo. Pokazali smo, da je pri varianti R277L in še posebej varianti D152G manj ugodna interakcija s P450 oksidoreduktazo, medtem ko imata varianti D152G in R431H manj ugodno interakcijo s substratom lanosterolom glede na divji tip CYP51A1. Škodljivost variant smo ocenili tudi na podlagi in vitro raziskav variant CYP51A1. Predlagamo, da se škodljive polimorfizme CYP51A1 vključi v personalizirano diagnostiko za izboljšanje genetskega svetovanja z določene redke bolezenske fenotipe.
B.06 Drugo
COBISS.SI-ID: 6312730sometorstvo magisteriju Lanosterol 14?-demetilaza (CYP51A1) iz naddružine citokromov P450 je esencialen encim v biosintezi holesterola. Katalitična aktivnost in struktura CYP51 sta evolucijsko zelo ohranjeni, polega tega je polimorfnost gena majhna. V zbirki 1000 človeških genomov smo zbrali naravne polimorfizme posameznega nukleotida (SNP), ki povzročijo drugačnosmiselno mutacijo aminokisline in imajo škodljivi napovedni vrednosti SIFT in PolyPhen-2. Postavili smo hipotezo, da zamenjavi aminokislin R271L in R425H (Q16850, UniProt) škodljivo vplivata na zvitje proteina. Zaporedji hCYP51 s polimorfizmoma smo pripravili z usmerjeno mutagenezo plazmida. Obe mutanti in nativni protein hCYP51 smo izrazili v bakteriji Esherichia coli in jih izolirali iz frakcij sferoplastov. S CO-diferenčnim spektrom smo preverili prisotnost katalitično aktivne oblike encima, pri čemer je imel samo nativni protein absorpcijski vrh pri 447 nm in s tem katalitično aktivnost. Absorpcijski vrh mutant hCYP51-R271L in hCYP51-R425H je bil pri 417 nm, kar je potrdilo prisotnost katalitično neaktivne oblike. Vpliv zamenjav aminokislin smo opredelili tudi s simulacijami molekulske dinamike in v simulacije dodali polimorfizem D146G. Rezultati so pokazali, da zamenjavi R425H in D146G onemogočita interakcijo encima s substratom, medtem ko zamenjavi R271L in D146G škodljivo vplivata na interakcijo z redoks partnerjem P450 citokrom oksireduktaza. Ker pridobljeni mutanti hCYP51 nista bili aktivni, saj nista imeli vrha v CO-diferenčnem spektru pri 445 nm, nismo preverili encimske učinkovitosti in vitro. Sklepamo, da zamenjavi R271L in R425H povzročita škodljive spremembe v sicer ohranjeni strukturi hCYP51. Spremembe v strukturi onemogočijo nastanek hem-tiolatne vezi v aktivnem mestu in zato je protein neaktiven.
D.10 Pedagoško delo
COBISS.SI-ID: 1537489347