Znanstveni prisprevek predstavljen na konferenci ASM Microbe. Uporabili smo računalniške metode napovedovanja strukture DNA, da smo pokazali kako nastajajo do sedaj neprepoznane frakcije parjenja DNA, katere se zmotno narobe interpretira in negativno vplivajo na nadaljne analize vzorcev v metagenomiki. V metagenomskih analizah uporabljamo metode neodvisne od kultivacije, kot so elektroforetske analize in sekvenciranje PCR pomnožene DNA. Nastanek zmazka v elektroforetskih agaroznih gelih, kamor smo aplicirali PCR pomnožene bakterijske gene za 16S rRNA, se razume kot pokazatelj napak pri PCR pomnoževanju. Domnevni pomnožki različnih velikosti zahtevajo eliminacijo, bodisi z rezanjem gelov ali pa z optimizacijo reakcije PCR. V tej študiji upoštevamo, da zakasnjeno potovanje DNA v elektroforezi ne povzročajo napake v PCR, temveč strukture dvoverižne DNA, ki so posledica parjenja pomnožene enoverižne DNA. S pomnoževanjem genov za 16S rRNA in heterogenih sintetičnih oligonukletodov smo ugotovili, da je obseg zmazka v agaroznih gelih sorazmeren s heterogenostjo nukleotidnega zaporedja variabilnih regij v genih za 16S rRNA. Denaturacijski alkalni geli so pokazali, da je bila vsa pomnožena DNA ustrezne velikosti. V eksperimentalnem sistemu sta se torej na podlagi parjenja DNA tvorili dve ločeni skupini struktur. Skupini struktur smo izolirali in sekvencirali z uporabo novo razvite metodologije za elektroelucijo DNA. Razvili smo nov bioinformatski postopek za karakterizacijo parjenja verig DNA, s katerim smo potrdili, da nastaja zmazek zaradi nepopolnega parjenja pomnožene DNA. Pokazali smo, da učinek nepopolnega parjenja DNA narašča sorazmerno s heterogenostjo DNA. Koncentrirana heterogena DNA tvori strukture, ki vodijo v nepravilno ravnanje z vzorcem DNA. Ker pa je zmazek v agaroznih gelih le strukturni del pravilno pomnožene DNA, nosi pomembno informacijo o bogastvu in raznolikosti tarčne DNA. Napačno ravnanje z vzorci 16S rRNA tako vodi v podcenjevanje bogatosti in raznolikosti bakterijskih vrst. Predlagamo, da se mora za natančno metagenomsko analizo izvor zmazka sprva identificirati, preden se zmazek lahko eliminira, s preizkušanjem pomnožene DNA v denaturacijskih alkalnih gelih.
COBISS.SI-ID: 1539178692
Znanstveni prisprevek predstavljen na konferenci ASM Microbe. Pri razvoju in širjenju odpornosti na antibiotike je konjugacija eden izmed poglavitnih procesov, ki omogoča horizontalni prenos genov med celicami. Konjugacijski sistemi v mobilnih genetskih elementih se razvijajo s kompenzacijskimi spremembami, ki omogočajo prilagoditev tako različnim pogojem, kot tudi različnim gostiteljem. Regija oriT je izredno pomembna za prenos konjugativnega plazmida in je substrat za nastanek relaksacijskega kompleksa, ki omogoča prenos mobilnega elementa. Rezultati preteklih raziskav nakazujejo, da je substrat oriT evolucijsko povezan s centralno komponento kompleksa, encimom relaksazo. Ker nastanek relaksacijskega kompleksa in njegovo delovanje regulirajo strukturne lastnosti DNA v regiji oriT, smo raziskali, če so te lastnosti evolucijsko ohranjene glede na nukleotidna zaporedja pripadajočih relaksaz. Pri tem smo temeljili na spoznanju raziskovalcev, da so na podlagi ohranjenosti aminokislinskih zaporedij določenih relaksaz definirane različne konjugativne skupine mobilnih elementov. Z računskim napovedovanjem strukturnih lastnosti DNA s pomočjo modelov Nearest Neughbour in Peyrard–Bishop–Dauxois v regijah oriT in z uporabo algoritmov strojnega učenja smo pokazali, da skupine mobilnih elementov lahko natančno razločimo z napovedanjem strukturnih lastnosti regij oriT (klasifikacijska natančnost 99%). Obratno pa skupine mobilnih elementov zelo slabo razločimo z uporabo nukleotidnih zaporedij teh istih regij (klasifikacijska natančnost 58 %). Glede na naše ugotovitve lahko trdimo, da so strukturne lastnosti regij oriT evolucijsko ohranjene glede na nukleotidno zaporedje pripadajočih relaksaz. Strukturna lastnost regije oriT je torej del konjugacijskega sistema in se razvija s proteinskimi komponentami sistema po principu koevolucije. Predvidevamo, da različna DNA zaporedja lahko tvorijo podobne strukturne lastnosti in s tem so enako učinkoviti substrati za točno določen tip relaksaze. Strukturna lastnost mesta oriT na plazmidih je zaradi tega pomembna pri razvoju novih metod napovedovanja procesov, ki omogočajo konjugacijo, in s tem nadzorovanja širjenja odpornosti na antibiotike.
COBISS.SI-ID: 1539178948
V članku je predstavljena metoda izgradnje in validacija celičnih biosenzorjev, ki izkoriščajo naravne mikroorganizme iz okolja za določanje koncentracije živega srebra ali drugih bioaktivnih učinkovin v okolju.
COBISS.SI-ID: 30060071