Projekti / Programi
Razvoj in optimizacija izolacije biotehnološko uporabnih molekul iz bakterijskih celic z metodo elektroporacije
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 7.00.00 |
Interdisciplinarne raziskave |
|
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 2.06 |
Tehniške in tehnološke vede |
Zdravstveni inženiring |
Ekstrakcija z elektroporacijo, protein, plazmidna DNA, šaržni sistem, pretočni sistem na laboratorijskem nivoju, Escherichia coli
Raziskovalci (8)
Organizacije (2)
Povzetek
Proteini in plazmidna DNA (pDNA), proizvedeni v bakterijah, so postali zelo pomembni v industriji in medicini. Uveljavljeni procesi za pridobivanje teh molekul (npr. mehanska razgradnja – proteini, alkalna liza – pDNA) pogosto temeljijo na uporabi močne mehanske sile ali kemikalij, kar lahko škoduje strukturi in funkcionalnosti proteinov ali pDNA. Poleg tega popolna razgradnja celice povzroči sproščanje večjih količin ostalih nečistoč, predvsem endotoksinov in genomske DNA (gDNA), zaradi česar so potrebni nadaljni postopki čiščenja. Posledično stroški čiščenja proteinov in pDNA v industrijski proizvodnji predstavljajo do 80% proizvodne cene, zato je potrebno razviti nove, bolj učinkovite ekstrakcijske metode in tako zagotoviti cenejše pridobivanje teh molekul iz bakterij.
Elektroporacija je pojav, pri katerem zaradi izpostavitve celice dovolj visokemu električnemu polju pride do strukturnih sprememb v membrani, zaradi česar postane membrana prepustna za molekule, ki sicer ne morejo prehajati skoznjo. V zadnjem času se elektroporacija uveljavlja tudi kot ekstrakcijska metoda za različne molekule iz mikroorganizmov.
V predlaganem projektu bomo razvili učinkovito metodo za ekstrakcijo proteinov in pDNA iz bakterij (ekstrakcijo z elektroporacijo) in s tem zagotovili zmanjšanje stroškov proizvodnje ob minimalnih investicijskih stroških. Zaradi neuporabe škodljivih kemikalij, pričakujemo tudi bistveno manjši vpliv na okolje. Preučevali bomo najpomembnejše dejavnike, ki lahko vplivajo na ekstrakcijski proces: parametre električnih pulzov (amplituda, polariteta, trajanje, število pulzov, ter njihovo ponavljalno frekvenco), fazo rasti bakterij, sestavo pufra in temperaturo med dovajanjem pulzov, ter po njem. Našo metodo bomo primerjali z mehansko razgradnjo in alkalno lizo. Glavne pričakovane prednosti predlagane metode bodo: večji izkoristek proteinov in pDNA, nižja koncentracija nečistoč (endotoksinov, gDNA), krajši postopek ekstrakcije (prej, kot v sekundi), manjši volumen lizata, neuporaba toksičnih kemikalij in možnost vgradnje v obstoječo proizvodno linijo ob nizki investicijski ceni.
Na podlagi izkušenj bomo razvili matematični model porazdelitve električnega polja, ki bo omogočal načrtovanje pretočne elektroporacijske komore in določanje optimalnega položaja elektrod in medelektrodne razdalje za učinkovito ekstrakcijo z elektroporacijo. Na podlagi pridobljenih rezultatov bomo razvili ekstrakcijo proteinov in pDNA z elektroporacijo v pretočnem sistemu in s tem dosegli četrto stopnjo tehnološke pripravljenosti. Prav tako bomo ocenili možnost uporabe dvostopenjskega sistema ekstrakcije v pretočnem sistemu, ki temelji na dveh ločenih dovajanjih električnih pulzov (v prvem koraku za pridobivanje proteinov in v drugem koraku pDNA), kar do sedaj še ni bilo razvito. Proteini so namreč lahko nezaželjene molekule v pDNA vzorcu, zato bi v prvem koraku ekstrakcije odstranili veliko večino proteinov in tako v drugem koraku pridobili čistejšo pDNA.
Cilji projekta so: (1) vzpostaviti in optimizirati eksperimentalni protokol za ekstrakcijo proteinov in pDNA z elektroporacijo iz bakterij v šaržnem sistemu, (2) vzpostaviti in optimizirati eksperimentalni protokol za ekstrakcijo proteinov (tudi specifičnega periplazmatskega proteina) in pDNA iz bakterij v pretočnem sistemu na laboratorijskem nivoju, (3) primerjati ekstrakcijo proteinov in pDNA z elektroporacijo z mehansko razgradnjo in alkalno lizo v smislu količine tarčne molekule (proteinov in pDNA), prisotnosti endotoksinov in gDNA, produktivnosti, koncentracijo in aktivnost specifičnega periplazmatskega proteina, cene in trajanja ekstrakcije in (4) oceniti možnost izvedbe selektivne ekstrakcije proteinov in pDNA z elektroporacijo iz istih bakterij v dvo-stopenjskem pretočnem sistemu na laboratorijskem nivoju. V celotnem trajanju projekta bomo iskali možnosti za zaščito intelektualne lastnine in prenos znanja v industrijo.
Pomen za razvoj znanosti
V zadnjih letih je pridobivanje znotrajceličnih molekul iz bakterij (npr. proteinov) za različne aplikacije v biotehnologiji in medicini pridobilo na pomenu. Metode, ki omogočajo ekstrakcijo teh molekul v industrijskih procesih pa se še vedno srečujejo s številnimi pomanjkljivostmi, kot so: uporaba kemikalij, ki niso zaželene v končnem produktu ali popolna mehanska razgradnja celice, zaradi česar je potrebno dodatno čiščenje želene molekule. Ravno ti zaključni procesi imajo velik vpliv pri ekonomskem vidiku celotne proizvodnje, saj čiščenje molekule lahko predstavlja do 80% proizvodne cene. Zato smo v sklopu projekta razvili novo metodo ekstrakcije proteinov iz bakterij – ekstrakcija z elektroporacijo, pri kateri brez uporabe okolju nevarnih kemikalij in popolne razgradnje bakterijskih celic ekstrahiramo proteine. Nova metoda je okolju bolj prijazna in cenejša v primerjavi z že uveljavljenimi metodami ekstrakcije (npr. mehanska razgradnja). Hkrati smo lahko ekstrahirali tudi plazmidno DNA in vložili patentno prijavo. Določili smo optimalne parametre električnih pulzov, temperaturo in bakterijsko fazo rasti. Tako bodo lahko raziskovalci povečali časovno in stroškovno učinkovitost novih poizkusov na področju ekstrakcije z elektroporacijo. Metodo smo tudi nadgradili in optimizirali z namenom obdelave večjih volumnov – ekstrakcija z elektroporacijo v pretočnem sistemu na laboratorijskem nivoju, s čimer se odpirajo tudi možnosti za tretiranje različnih mikroorganizmov (npr. različnih bakterij, kvasovk, mikroalg itd.) z elektroporacijo z namenom pridobivanja njihovih znotrajceličnih molekul v prehrambni ali farmacevtski industriji, inaktivaciji mikroorganizmov v tekoči hrani ipd. Novo razvita ekstrakcija z elektroporacijo v pretočnem sistemu lahko pomembno prispeva k hitrejšemu in cenejšemu razvoju novih aplikacij in ima več koristnih učinkov na razvoj znanosti na področju elektroporacije in širše.
Pomen za razvoj Slovenije
Z rezultati projekta smo utrdili položaj Slovenije kot eno vodilnih na področju elektroporacije in na njej temelječih tehnologij. Namreč ekstrakcija proteinov iz bakterij z elektroporacijo v pretočnem sistemu (tehnološka raven pripravljenosti stopnje 4) je mednarodnega pomena, saj se v zadnjih letih močno uveljavlja proizvodnja in ekstrakcija različnih molekul (npr. proteinov) iz bakterijskih celic. Poleg tega so rezultati projekta pritegnili tuje raziskovalce iz Srbije in Poljske, ki so poiskali našo ekspertizo in opremo (pretočni sistem z elektroporacijo) za svoje raziskave. Pridobljeno znanje v okviru tega projekta smo umestili v pedagoški proces Univerze v Ljubljani (Fakulteta za elektrotehniko) v okviru tako dodiplomskega (diplomska naloga; COBISS ID 11883860), kot podiplomskega (doktorska disertacija; COBISS ID 10655060) študijskega programa. V sklopu tega projekta razvit pretočni sistem z elektroporacijo je bil predstavljen tudi na vsakoletno organizirani podiplomski šoli “Electroporation based Technologies and Treatments”, ki jo obiskujejo študentje in raziskovalci iz celega sveta, delujočih na področju elektroporacije. Pridobljeni rezultati so bili predstavljeni na domačih in mednarodnih konferencah ter objavljeni v SCI indeksiranih znanstvenih revijah, kar je izrednega pomena za prepoznavnost in uveljavljanje Republike Slovenije v mednarodnem okolju. V sklopu projekta smo v prestižni reviji »Trends in Biotechnology« z visokim faktorjem vpliva (5 letni faktor vpliva je 13,382) tudi objavili pregled na elektroporaciji temelječih aplikacij v biotehnologiji. Delo je bilo izbrano s strani ARRS za Odličnega v znanosti v letu 2016. Slednje močno pripomore k prepoznavnosti in uveljavljanju raziskovalne skupine in Republike Slovenije v mednarodnem okolju.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2014,
2015,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2014,
2015,
zaključno poročilo
