Projekti / Programi
Structural insight into the mechanism of Clostridium difficile surface formation
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.05.00 |
Naravoslovje |
Biokemija in molekularna biologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B000 |
Biomedicinske vede |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| 1.06 |
Naravoslovne vede |
Biologija |
Clostridium difficile, površinska (S-) plast, sekundarni polisaharidi, biosintezna pot PSII, encim, kristalna struktura, validacija tarč za zdravila
Raziskovalci (12)
Organizacije (4)
Povzetek
Celična stena po Gramu pozitivnih bakterij je sestavljena iz proteinov in peptidoglikana z izraščajočimi sekundarnimi polisaharidi, ki se med različni vrstami razlikujejo v kemijski sestavi in strukturi. Sekundarni polisaharidi celične stene so kovalentno pritrjeni na peptidoglikan in lahko predstavljajo več kot polovico mase celične stene. Tvorijo gosto mrežo negativnih nabojev in vplivajo na kationsko homeostazo, prepustnost membrane, občutljivost na antibiotike in na preživetje v gostitelju. Pri številnih bakterijah delujejo tudi kot sidra, ki nekovalentno vežejo zunanjo, parakristalinično proteinsko površinsko plast, imenovano S-plast. Medtem ko smo strukturo S-plasti bakterije Clostridium. difficle že deloma razjasnili, so mehanizmi odgovorni za organizacijo njene strukture in vezave na peptidoglikan še vedno slabo raziskani.
C. difficile je nevaren bolnišnični patogen. Ob porušeni črevesni mikrobioti pacienta spore bakterije C. difficile vzklijejo in infekcija, četudi zdravljena, se lahko ponovi in vodi do življenjsko nevarnih zapletov. Pogosta uporaba antibiotikov širokega spektra za zdravljenje okužb s C. difficile vodi v naraščanje proti (številnim) sevov. Glede na to, da stik z gostiteljem poteka na površini bakterije in da je S-plast bakterije C. difficile esencialni virulenčni dejavnik, je vredno preučiti z njo povezane procese.
Manipulacije genov za encime, vpletene v biosintezo sekundarnih polisaharidov bakterije C. difficile, so pokazale, da njihove okvare vodijo do motenj bakterijske rasti, razpršene celične stene, okvar sidranja, spremenjenega nalaganja in izločanja sekundarnih polisaharidov, do okvar v morfologiji in izgradnji S-plasti, sprememb v tvorbi biofilmov in nenazadnje do sprememb v virulenci. Vse to nas je spodbudilo k raziskavam mehanizmov izgradnje S-plasti bakterije C. difficile, pri čemer se nameravamo osredotočiti predvsem na encime, ki so vključeni v biosintezo sekundarnih polisaharidov. Poleg tega lahko karakterizacija omenjenih encimov razširi naše razumevanje biogeneze ostalih polimerov bakterijskih celičnih sten.
S predlaganim projektom želimo pridobiti nov vpogled v mehanizme biosinteze sekundarnih polisaharidov in določiti njihov vpliv na izgradnjo S-plasti. Preučevali bomo tri skupine encimov, ki sodelujejo pri biosintezi sekundarnih polisaharidov (encime, vključene v pretvorbo manoze, glikoziltransferaze in encime, ki pripenjajo sekundarne polisaharide na peptidoglikan). Uporabili bomo komplementarne pristope molekularne biologije, analize kristalnih struktur, meritev encimskih aktivnosti, strukturno podprtega virtualnega rešetanja ligandov, klasične sinteze inhibitorjev, biokemijske analize, masne spektrometrije in mikroskopije (optične, elektronske in CryoEM) za opazovanje (fragmentov) nativnih in gensko spremenjenih bakterij ter bakterij, tretiranih z inhibitorji.
Verjamemo, da ima sistematično raziskovanje celotne skupine encimov biosinteze sekundarnih polisaharidov potencial za temeljna odkritja v zvezi z njihovimi vlogami pri biosintezi sekundarnih polisaharidov in izgradnji S-plasti. Uspešen izid tega projekta bo postavil temelje novih programov odkrivanja zdravil, ki imajo potencial izboljšati zdravljenje življenjsko nevarnih okužb z bakterijo C. difficile na vrstno specifičen način in s tem zmanjšati tveganje za širitev odpornosti proti antibiotikom.
Pomen za razvoj znanosti
Predlagani projekt je konkurenčna pobuda, ki se nanaša na dobro znan zdravstveni problem (bolnišničnih) bakterijskih okužb in širjenja njihove odpornosti proti antibiotikom ter je na zahtevnem področju biomedicinskih znanosti svetovnega pomena. Medtem ko je po Gramu pozitivna bakterija C. difficile lahko del zdravega človeškega/sesalskega črevesnega trakta, lahko porušena črevesna mikrobiota, ki je običajno posledica antibiotične terapije, vodi v (super)okužbo s to bakterijo in potencialno hudo nekrotično bolezen debelega črevesa.
Zunanja plast površine bakterije C. difficile je sestavljena iz proteinske strukture, imenovane S-plast, ki je esencialni virulenčni factor in je nekovalentno vezana na celično steno preko sekundarnih polisaharidov. Pomanjkanje vpogleda v mehanizme, ki so podlaga za tvorbo S-plasti, narekuje raziskavo encimov, ki sodelujejo pri biosintezi sekundarnih polisaharidov in določitev vloge sekundarnih polisaharidov v procesu sestavljanja S-plasti. Predlagani projekt bo prvi, ki bo zagotovil strukturni in biokemijski vpogled v proteine, vključene v biosintezo sekundarnih polisaharidov bakterije C. difficile in položil temelje za prihodnje študije sestave in structure S-plasti z zagotavljanjem materialov, kot so proteini in majhne molekule in strukturnega vpogleda ter novih metodologij, kot sta določanje strukture 2D proteinskih združkov z elektronsko mikroskopijo in (točkovne) mutacije v genomu C. difficile z nedavno okarakteriziranim endogenim CRISPR-Cas sistemom. Pridobljeno znanje bo moč prenesti na druge po Gramu pozitivne bakterije s homolognimi biosinteznimi potmi sekundarnih polisaharidov in na mikrobe, obdane s S-plastmi.
Verjamemo, da bodo rezultati projekta osvetlili možne načine preprečevanja okužb z bakterijo C. difficile in zagotovili temelje za nove programe razvoja zdravil.
Objavljene raziskave v vrhunskih revijah bodo povečale prepoznavnost slovenske znanosti.
Pomen za razvoj Slovenije
The proposed project is a competitive initiative in a challenging area of biomedical science related to a well-known health problem of (nosocomial) bacterial infections and increasing antibiotic resistance aiming to have a worldwide impact. C. difficile is a Gram positive bacterium and can be a normal inhabitant of the human/mammal intestinal tract. However, disruption of the normal gut microbiota usually following antibiotic therapy leads to C. difficile (super)infection and potentially severe necrotizing disease of the large intestine.
The outermost surface of C. difficile is composed of a protein structure called the S-layer, an essential virulence factor that is non-covalently attached to the cell wall through secondary polysaccharides. The lack of insight in the mechanisms underlying S-layer formation suggests to explore the enzymes involved in biosynthesis of secondary polysaccharides and to pin point the role of secondary polysaccharides in the S-layer assembly process. The proposed project will be the first to provide structural and biochemical insight into the proteins involved in the biosynthesis of secondary polysaccharides of C. difficile and will lay the foundation for the future studies investigating the S-layer composition and structure by providing materials, such as proteins and small molecule compounds, structural insight, and new methodologies, such as structure determination of 2D protein assemblies by electron microscopy and (point) mutations in C. difficile genome by recently characterized endogenous CRISPR-Cas system. The gained knowledge and methodologies will be applicable to other Gram positive bacteria with homologous secondary polysaccharide biosynthetic pathways and microbes enclosed in S-layers.
We believe that the results of the project will illuminate possible ways of preventing infections with C. difficile and provide foundations for novel drug discovery programs.
We expect that published research in top ranking journals will increase visibility of Slovenian science.
